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    Avivasysbio ELISA 常见问题

    发布时间: 2022-09-19  点击次数: 114次

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    Avivasysbio  ELISA 常见问题

    你能推荐我的样品稀释吗?

    我可以使用该套件多少次?

    我怀疑我的样本可能含有干扰因素(溶血/脂血/血液等)。这将如何影响检测?

    为什么标准瓶中的颗粒大小不同?

    我应该如何裂解我的细胞/组织?

    我需要多少样品?

    我的样品测量值随着进一步稀释而增加?

    我的样品测量值低于空白?

    我的空白很高,我的标准很低?

    我可以使用血液样本吗?

    Kit 可以分开运行吗?

    标准曲线低于空白或空白太高

    为什么这个试剂盒不能检测我购买的另一种市售重组蛋白?

    竞争性检测:0 (ng/mL) 孔与空白孔

    ELISA 计算说明

    我应该使用多少个细胞来制备细胞裂解物样本?

    抗凝剂(又名,柠檬酸盐对我的检测有用吗?

    检测 xxx(血浆、血清等)中外泌体上的跨膜蛋白。是否需要提取蛋白质?

    样品类型的长期储存:

    标准曲线+空白有效,样品类型为阴性。

     

    1. 你能推荐我的样品稀释吗?

    由于不同用户和样品类型的蛋白质表达水平范围很大,我们不建议针对每种应用进行特定稀释。

     

    我们建议始终使用试剂盒中定的稀释剂(通常是样品稀释剂或标准稀释剂)以至少 1:2 的比例稀释。

     

    *佳稀释度是样品信号强度落在动态范围中间的位置,应由以下任一决定:

     

    在执行完整实验之前,测试您的队列中连续稀释的代表性样本。或者,如果样本量有限,也可以使用相同的方法使用由几个样本组成的小池。

    -或者-

     

    有关预期浓度,请参阅已发表的文献,并根据试剂盒的预期动态范围得出*佳稀释水平。

     

    2. 我可以使用该套件多少次?

    该板是 12 x 8 孔条。将未使用的条带放回铝箔袋中。

     

    两次运行有两个标准样品瓶。不要储存重构的标准供以后使用。

     

    只准备立即运行所需的检测试剂。

     

     

    3. 我怀疑我的样本可能含有干扰因素(溶血/脂血/血液等)。这将如何影响检测?

    干扰因素会影响试剂盒的生物成分(捕获/检测抗体),并可能影响吸光度读数。为了减轻可疑的干扰因素:

     

    稀释是减轻干扰因素的*佳方法。根据试剂盒的动态范围,在目标分析物浓度允许的范围内,用的试剂盒稀释剂稀释样品。

     4°C 下以 10,000 rpm 离心样品 10 分钟可以去除一些干扰因素。

    异嗜性或动物结合抗体必须使用特定的抗干扰缓冲液处理。

     

    4. 为什么标准瓶中的颗粒大小不一?

    这是冻干的正常现象。颗粒可能看起来小而致密或蓬松和絮状。这是由于在干燥过程中整个冻干室的温度和压力变化非常小。这不会影响标准,只要它们被*重组。

     

     

    5. 我应该如何裂解我的细胞/组织?

    推荐的机械裂解方法包含在协议中。我们建议使用冷冻/解冻或超声波进行机械裂解以裂解细胞。细胞应在 PBS 缓冲液中裂解。

     

    如果出现以下情况,化学裂解是可以接受的:

     

    任何清洁剂、有机溶剂或还原剂的最终浓度均小于 0.01%

    您感兴趣的靶标的浓度足够高,以至于在将裂解缓冲液*稀释至上述检测可接受的浓度时,可以根据试剂盒的动态范围对其进行检测。

    在这一步,请检查组织/细胞系的预期 RNA-seq 数据,以及蛋白质在 Uniprot 上的细胞中表达的位置,以确保它有意义。

     

    6. 我需要多少样品?

    试剂盒需要 100 uL,因此如果最小稀释度为 1:2,则需要 50 uL

     

     

    7. 我的样品测量值随着进一步稀释而增加?

    这可能是几个问题。通常,这是由于样品中的干扰因素造成的。通常这发生在血清或血浆中,而不是细胞/组织/超级细胞。*佳样品稀释水平必须通过连续稀释来确定。如果样品测量值显示从标准曲线的反向计算线性回归的线性测量值跨越 2  3 次稀释,则为*佳稀释点。

     

     ELISA 中,更多的稀释总是更好,因为它可以减轻任何潜在的测定干扰并提供更准确的测量。

     

     

    8. 我的样品测量值低于空白?

    如果样品表达的目标分析物浓度低于测定的动态范围,这是正常的。空白测量值更高,因为样品中没有任何东西,导致非特异性结合。在某些情况下,样品中的少量基质实际上会减少非特异性结合。

     

     

    9.我的空白很高,我的标准很低?

    这可能是一个复杂的问题,无论是用户故障还是套件故障。

     

     

    10. 我可以使用血液样本吗?

    您可以将此试剂盒与全血一起使用,但我不推荐它。全血有很多干扰因素,可能会影响测试结果。如果您有全血,我建议将其处理成血清或血浆以获得更好/一致的结果。

     

     

    11. Kit 可以分开运行吗?

    我会推荐:

     

    1. 在上课前准备和稀释您的样品。

    2. 在上课前准备标准曲线稀释液。最好在检测前直接准备这些和样品,但它们可能会在 30 分钟左右就可以了。

    检测应在制备试剂后 4 小时内完成。检测器和偶联物稀释液可以在前一步孵育期间使用前制备。

     

    请注意,如果需要,您可以稍微调整样品/标准孵育步骤,而不会过多地损害灵敏度。该测定将运行相同,但只会提供稍低的整体信号水平。

     

     

    12. 标准曲线低于空白或空白过高

    基于观察到低标准曲线低于空白,我怀疑这是以下一项或多项:

     

    1. 洗孔不充分。

    2. 出现移液错误。

    3. 标准稀释错误。

    4. 试剂制备错误。

     

    13. 为什么这个试剂盒不能检测我购买的另一种市售重组蛋白?

    不是所有的市售重组蛋白都能被检测到。需要考虑重组蛋白的抗体检测存在固有的困难。重组蛋白的折叠可能不同于内源天然形式,并且可能阻止抗体接近表位。标记蛋白尤其如此。

     

    标准氨基酸序列可能与您的阳性对照序列和表达系统不同。

     

    即使您使用相同长度的重组蛋白,不同的表达系统、不同的糖基化和不同的蛋白质折叠也会改变抗体结合。这可能就是为什么此试剂盒中的抗体无法检测您购买的重组 NEDD9 蛋白的原因。

     

     

    14. 竞争性检测:0 (ng/mL) 孔与空白孔

    对于竞争性测定,0 ng/mL 的孔可检测抗原--复合物与试剂盒反应的信号量,而不会与您的样品/标准品发生竞争。由于该孔仅包含抗原--复合物,因此它与 TMB 的反应强,因此具有最深的蓝色阴影。0 ng/mL 孔的目的是让检测中的所有试剂和缓冲液都在没有标准品的环境中,这样您就可以确认您的标准品和抗原--复合物具有竞争力。

     

    另一方面,竞争性测定的空白将是一个没有样品且没有抗原--复合物的孔(手册中的步骤 10.4),它将检测试剂盒的非特异性结合,供您从中减去。它应该只包含样品稀释剂。

     

     

    15. ELISA 计算说明

    可以通过几种不同的方式通过标准曲线回归得出样品测量值。这真的取决于你有什么软件。

     

    幂指数函数或线性回归可以正常工作,对于只有 Excel 等软件的用户来说通常是简单的。如果您的标准曲线相对较直,则可能不需要 4-P(四参数逻辑 (4-PL))。

     

    如果曲线是 S 型曲线,如果您有一些软件,我们总是建议进行 4-P 拟合。如果您有可以使用 4 参数 S 型曲线拟合模型的软件(例如 PRISM),这通常对许多 ELISA 用户来说更准确,但并不是每个人都具备这种软件功能。

     

     

    16. 我应该使用多少个细胞来制备细胞裂解物样本?

    这将取决于客户研究的目标水平。通常以 1x108cell/ml 裂解细胞会起作用。

     

     

    17. 抗凝剂(又名,柠檬酸盐对我的检测有效吗?)

    对于我们的试剂盒,我们推荐肝素和 EDTA 作为抗凝剂,因为它们通常在大多数情况下产生更好的结果。

     

    以下是关于用于 ELISA 样品处理的抗凝剂的一般优缺点列表:

     

    抗凝物        骗局

    柠檬酸盐 适用于大多数凝血测试,可保护血因子   溶解性差,抗凝作用弱。

    乙二胺四乙酸 对红细胞和白细胞的形态影响不大      对血小板聚集有影响。不适合检测凝血和血小板功能相关实验

    肝素 抗凝能力强,不影响血细胞体积。不易发生溶血。在高温下保持稳定性 导致白细胞聚集。肝素抗凝样品应尽快使用,否则很快会再次凝固

    如果有机会,建议使用不同的抗凝剂。

     

     

    18. xxx(血浆、血清等)外泌体上跨膜蛋白的检测。是否需要提取蛋白质?

    我们推荐以下蛋白质提取缓冲液:

     

    英杰华 SKU   云克隆 SKU   产品名称

    液晶显示器00001  IS007-裂解缓冲液 1     裂解缓冲液:膜蛋白

    液晶显示器00002  IS007-裂解缓冲液 2     裂解缓冲液:细胞质蛋白(结构)

    液晶显示器00003  IS007-裂解缓冲液 3     裂解缓冲液:细胞质蛋白(核基质、膜)

    OLCD00004   IS007-裂解缓冲液 4     裂解缓冲液:核基质蛋白、核内体、其他细胞器

    19、样品种类的长期保存:

    样品应分装在 -80oC 下。蛋白质变质可能/可能发生,但这*取决于蛋白质的稳定性。我们的实验室使用新鲜样品进行验证,但尚未进行蛋白质稳定性测试——如果可能,我们建议使用新鲜样品进行检测。

    20. 标准曲线+空白工作,样品类型为阴性。

    一般来说,如果是血清/血浆,可能是由干扰(基质效应)引起的。如果样品类型是细胞裂解物/组织匀浆,可能是由于使用了去污剂/化学裂解物。我们建议机械裂解是安全的。

     

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