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    cytoskeleton运动蛋白质常见问题

    发布时间: 2024-05-23  点击次数: 140次

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    运动蛋白资源目录

    运动蛋白质类

    真核驱动蛋白运动蛋白利用ATP水解的能量沿着细胞骨架微管网络移动货物,如染色体和小泡[1]。它们在细胞内运输的几乎所有方面都发挥着重要作用,并参与广泛的生理过程,包括胚胎发育[2]、轴突运输[3]和细胞分裂[4]。。。(点击此处了解更多关于运动蛋白的信息)。

    运动蛋白质常见问题

    问题1:如何使用驱动蛋白进行药物筛选?

    答案1:动蛋白运动蛋白利用微管(MT)作为底物,在细胞内协调各种动力学事件。它们已经被证明可以沿着MT轨道运送染色体和血管等货物。驱动蛋白通过水解利用ATP的能量来发挥作用,这种活性在MT存在的情况下会大大增强。为了筛选调节运动蛋白和MT之间相互作用的药物,MT激活的驱动蛋白ATP酶测定可以用作驱动蛋白的MT激活的ATP酶活性的测试。细胞骨架开发了两种这样的测定法,一种是终点测定法,另一种是动力学测定法,可用于发现和优化驱动蛋白调节剂。两种测定都测量由微管激活的驱动蛋白三磷酸腺苷(ATP酶)活性产生的无机磷酸盐(Pi)水平。这两种驱动蛋白-ATP酶生物化学分析试剂盒(Cat.#BK053BK060)提供MT和驱动蛋白重链(KHC)蛋白以及必要的缓冲液和试剂,以测量Pi的产生,作为筛选调节驱动蛋白和/MT功能相互作用的药物的手段。这些试剂盒可用于发现驱动蛋白抑制剂和激活剂(Cat.#BK053BK060)以及测定驱动蛋白运动蛋白的VmaxKcat值(Cat.#BK060

    问题2:有哪些试剂盒可用于表征推定的运动蛋白?

    答案2:运动蛋白利用微管作为底物,这意味着运动蛋白是微管相关蛋白(MAP)的一种类型。为了证实推定的运动蛋白与微管结合,可获得Cytoskeley的微管结合蛋白旋转下降测定试剂盒(Cat.#BK029)。待评估的蛋白质需要通过考马斯蓝或银染色或用蛋白质本身的抗体或与蛋白质缀合的标签(hismyc等)进行可视化。不可水解的ATP类似物,例如AMPPNP,通常以510mM使用以维持微管附着。微管还激活运动蛋白的ATP酶活性,这可以用我们的驱动蛋白ATP酶测定法之一(Cat.#BK053BK060)来测量。这些试剂盒可用于发现驱动蛋白抑制剂和激活剂(Cat.#BK053BK060)以及测定驱动蛋白运动蛋白的VmaxKcat值(Cat.#BK060Cytoshelle,股份有限公司还提供Biochem试剂盒(Cat.#BK027),其允许使用荧光标记的微管可视化运动蛋白运动。

    技术支持

    时间:周一至周五,山地标准时间上午8点至下午5

    Cytoskeley的技术服务团队提供无与比的服务和支持,让您与拥有开发和测试我们在现场实验室创建的分析、试剂盒和试剂第一手经验的科学家取得联系。您可以上述号码致电我们的技术服务小组,或通过上述电子邮件地址以电子方式提交您的问题。问题通常会在一个工作日内通过电话或电子邮件回复。还请务必查看我们的常见问题解答、技术提示和其他产品信息,这些信息可以通过产品类别或目录号访问。

    运动蛋白质

    Cytoskeley Motor-Werks™CMW)产品线由Cytoskelle家生产和销售。这些产品促进了运动蛋白领域的研究和药物发现的进展(Funk等人,2005)。我们专注于生产高纯度和生物活性的真核生物和真菌来源的驱动蛋白和肌球蛋白家族蛋白。这些试剂用于抗有丝分裂药物的发现和运动活性的机制研究。Cytoskeley Motor-Werks™生产线还包含几种Biochem试剂盒、抗体和其他与运动相关的试剂(如微管稳定剂紫醇,Cat.#TXD01)和蛋白质(如预形成的微管,Cat.#MT002)。

    有关运动蛋白的更多信息,请单击上面的关于"选项卡。

    概述

    真核驱动蛋白运动蛋白利用ATP水解的能量沿着细胞骨架微管网络移动货物,如染色体和小泡[1]。它们在细胞内运输的几乎所有方面都发挥着重要作用,并参与广泛的生理过程,包括胚胎发育[2]、轴突运输[3]和细胞分裂[4]。许多驱动蛋白在细胞分裂中的重要作用,以及驱动蛋白的过度表达与视网膜母细胞瘤等癌症有关[5],使它们成为抗有丝分裂症发展的非常有吸引力的靶点。观察到许多驱动蛋白仅在细胞分裂过程中表达,这也表明它们可能优于目前的抗有丝分裂药物靶点,如普遍表达的微管蛋白[67]

    Kinesins的一般结构

    所有驱动蛋白的标志是存在一个保守的~340个氨基酸的运动结构域[8]。这个领域分为两个主要部分。第一部分是催化核心区,由催化ATP水解的ATP结合位点[9]和将马达束缚在MT轨道上的微管(MT)结合位点[10]组成。第二部分是约10-40个氨基酸的颈部区域,被认为有助于单向运动[11]。在球状运动结构域之外,存在一个α-螺旋卷曲螺旋区,参与蛋白质的同源和异源寡聚,最常见的是以同源二聚体的形式存在。这个区域被称为茎[8]。柄通常将运动域与称为尾部的第二个球状域分开。尾部域被认为与货物绑定有关。

    Kinesin分类与结构多样性

    迄今为止,从酵母(酿酒酵母含有6种驱动蛋白)、真菌到人类(目前有13种驱动肽[12]),已经在生物体中鉴定出约150种驱动素。分类基于运动域同源性,特别是在特定类别的颈部和邻近区域[12]。目前人们一致认为驱动蛋白至少有九类[121314]。如表1所示。命名法(表1中以粗体显示)基于运动蛋白结构域在驱动蛋白中的位置,因此N-蛋白在蛋白的氨基末端含有运动结构域,而C-M-运动蛋白分别位于蛋白的羧基末端和中间[12]

    Cytoskeley提供的重组驱动蛋白已被设计为结合运动结构域,包括颈部区域和大部分柄结构域,这些构建体被设计为产生正常的二聚体结构,尽管这尚未通过沉淀分析进行测试。在给定类别的驱动蛋白中,约340个氨基酸的运动区的同源性可以在N-1类(最高度保守的囊泡运输运动)的74-81%同一性和C类(最发散的)的46-50%同一性之间变化[13]。类之间的同一性百分比下降到35-40%[13]左右。对现有运动数据的结构比较表明,不同驱动蛋白类别的运动之间存在显著的构象变异,结构差异集中在六个区域,其中大多数在微管结合或将核心运动与柄区连接方面具有重要的功能[911]。考虑到不同驱动蛋白类别的马达之间相对较高的百分比差异,很可能会确定类别特异性驱动蛋白药物。这一结构证据得到了生物化学数据的支持,这些数据表明,不同种类的果蝇驱动蛋白对各种ATP类似物的利用不同[15]。考虑到ATP结合口袋是运动结构域中最高度保守的区域之一,这一点令人印象深刻[9]。这些实验表明,即使在给定的物种内,驱动蛋白类别之间也存在明显的结构差异,可以用于选择性药物开发。在这方面,令人鼓舞的是,我们已经能够在HTS测定中检测驱动蛋白之间的类似物特异性(见I期报告)。因此,我们相信,我们将能够检测出具有潜在抗癌药物用途的类特异性化合物。

    *大胆的分类系统取自Hirokawa[12]。括号中的分类系统在文献中经常使用,取自MooreEndow[14]

    **An,巢状曲霉:Hs,智人:Dm,黑腹果蝇。

    黄色/绿色阴影表示仅在细胞分裂中起作用的驱动蛋白类别,浅黄色阴影表示包含在细胞分裂或有丝分裂中起功能的驱动素类别,未阴影区域表示仅参与囊泡运输的驱动肽。

    寻找潜在的抗真菌药物需要我们识别一类驱动蛋白内的结构变化,如上所述,运动区域在任何给定类别的驱动蛋白中的变化都小于类别之间的变化。在这方面有两点值得注意;首先,我们的主要真菌靶标是BimC蛋白,它属于最多样化的驱动蛋白类,在运动区内表现出约47%的同一性(任何低于60%的同一度都被认为是可接受的差异靶标特异性),其次,我们在重组蛋白靶标中包括了高度可变的柄区(见实验方法),它提供了相对蛋白质特异性的靶标(<20%同一性)[13]。重要的是,对柄区的抗体抑制已被证明可抑制体内运动功能[16]

    用于HTS测定的Kinesin靶点的选择

    驱动蛋白的细胞功能可分为两大类;膜囊泡和细胞器的运输和定位,以及有丝分裂纺锤体的形态发生和染色体运动[12]。一类驱动蛋白在功能上有许多相似之处,这并不奇怪。从表1中可以看出,九类驱动蛋白运动中有四类专门参与细胞分裂(表1的黄色/绿色阴影区域),两类(C-M-)同时含有囊泡转运蛋白和有丝分裂运动(表1中的浅黄色阴影区域);三类(N-INIIIN-IV)专门参与囊泡转运(表1未阴影区域)。

    我们从每一类驱动蛋白[61721222628293039]中选择了一种人类同源物,并从人类病原体曲霉菌中选择了两种真菌驱动蛋白[34],作为HTS测定的基础(如表1所示)。通过用化合物文库筛选每种蛋白质,可以生成一个初级数据库,该数据库将允许鉴定选择性靶向细胞分裂特异性类人驱动蛋白的化合物(表1的深色阴影区域),同时对囊泡运输驱动蛋白没有影响。这类化合物最有可能是治疗人类疾病如癌症的有效抗有丝分裂剂。同样,与驱动素曲霉菌特异性反应的化合物可以作为潜在的抗真菌药物进行研究。

    Kinesins作为有效的抗有丝分裂靶点

    在开始一项昂贵的药物发现计划之前,必须严格评估所提出的蛋白质是否符合有效药物靶点的标准。驱动蛋白将成为抗有丝分裂药物开发的优秀靶点的证据来自一系列实验方法,包括突变分析[40]、抗体抑制实验[732]和驱动蛋白活性的反义抑制[19]。表1总结了这一证据,其中可以看出,对给定的有丝分裂特异性驱动蛋白的功能性抑制导致细胞分裂的抑制。例如,通过向HeLa细胞中微量注射抗-Eg5抗体对HsEg5的体内抑制导致>80%的细胞停止有丝分裂。使用过表达的HsEg5运动结构域突变体证实了这些结果[7]。在另一组实验中,人类细胞系中无运动CENP-E蛋白的体内过表达导致染色体在中期板上排列失败,并导致有丝分裂阻滞[22]。此外,向HeLa细胞微量注射CENP-E抗体也会导致持续417小时的有丝分裂阻滞,并导致所有细胞进入凋亡[22]。由于这两种蛋白质都包含在我们的HTS测定中,我们非常希望针对这些马达的化合物具有治疗相关性。有趣的是,N-V类驱动蛋白(表1)含有与视网膜母细胞瘤有关的人类驱动蛋白[5]。这种运动的非洲爪蟾同源物的反义和抗体抑制导致有丝分裂阻滞和细胞死亡[19]这一事实令人鼓舞,表明靶向人类促色蛋白的药物可能在治疗/预防视网膜母细胞瘤方面有用。

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