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    VectorBuilder矢量辅助线

    发布时间: 2024-04-17  点击次数: 125次

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    VectorBuilder矢量辅助线

    VectorBuilder整合了数十年实验室经验和发表的研究成果中的矢量学知识,为我们提供矢量指南。在这里,你可以了解更多关于基因传递各个方面的生物学、历史、机制和应用。我们在这里是为了确保您拥有优化实验设计所需的一切。

     

    规则质粒基因表达载体

    概述

     通过常规转染将质粒载体递送到哺乳动物细胞中是生物医学研究中应用广泛的程序之一。尽管多年来已经开发了许多更复杂的基因递送载体系统,如慢病毒载体、腺病毒载体、AAV载体和piggyBac,但传统的质粒转染仍然是许多实验室基因递送的主力。这在很大程度上是由于其技术简单以及在广泛的电池类型中具有良好的效率。用常规质粒载体转染的一个关键特征是它是短暂的,只有极低比例的细胞将质粒稳定整合在基因组中(通常小于1%)。

     

    关于这个矢量系统的更多信息,请参阅下面的论文。

    参考文献主题

    摩尔生物技术。16:1512000)哺乳动物基因表达载体设计综述

    EMBO J.12:25391993)转录阻断剂防止转录干扰

     

     

    集锦

    我们的载体经过优化,可在大肠杆菌中进行高拷贝数复制和高效转染。用载体转染的细胞可以基于用户选择的标记基因表达来选择和/或可视化。

     

    优势

     

    技术简单性:通过传统转染将质粒载体输送到细胞中在技术上是简单的,并且比需要包装活病毒的基于病毒的载体容易得多。

     

    非常大的货物空间:我们的载体可以容纳约30kb的总DNA。质粒骨架仅占约3kb,留下足够的空间来容纳用户感兴趣的序列。

     

    高水平表达:质粒的常规转染通常会在细胞中产生非常高的拷贝数(每个细胞高达数千个拷贝)。这可以导致载体上携带的基因具有非常高的表达水平。

     

    缺点

     

    载体DNA的不整合:质粒载体的常规转染也被称为瞬时转染,因为载体在没有整合的细胞中主要停留为游离体DNA。然而,质粒DNA可以以非常低的频率(根据细胞类型,每102106个细胞中就有一个)久整合到宿主基因组中。如果将耐药性或荧光标记物掺入质粒中,则可以在延长培养后通过药物选择或细胞分选获得稳定整合质粒的细胞。

     

    有限的细胞类型范围:质粒转染的效率因细胞类型而异。非分裂细胞通常比分裂细胞更难转染,原代细胞通常比永生化细胞系更难转染。周知,一些重要的细胞类型,如神经元和胰腺β细胞,很难转染。此外,质粒转染在很大程度上仅限于体外应用,很少在体内使用。

     

    基因递送的不均匀性:尽管成功转染会导致每个细胞的转染质粒载体的平均拷贝数非常高,但这可能是高度不均匀的。一些细胞可以携带许多拷贝,而另一些细胞携带的拷贝很少或根本没有。这与基于病毒的载体的转导不同,后者往往导致相对均匀的基因递送到细胞中。

    关键组件

    启动子:驱动你感兴趣的基因的启动子就放在这里。

     

    KozakKozak一致序列。它被放在感兴趣的ORF的起始密码子前面,因为它被认为有助于真核生物中的翻译起始。

     

    ORF:你感兴趣的基因的开放阅读框架放在这里。

     

    SV40晚期pA:Smian病毒40晚期多腺苷酸化信号。它促进上游ORF的转录终止。

     

    巨细胞病毒启动子:人类巨细胞病毒立即早期启动子。它驱动下游标记基因的普遍表达。

     

    标记:药物选择基因(如霉素耐药性)、视觉可检测基因(如EGFP)或双报告基因(如EGFP/Neo)。这允许用载体转导的细胞被选择和/或可视化。

     

    BGH pA:牛生长激素多腺苷酸化。它促进上游ORF的转录终止。

     

    pUC ori:复制的pUC起源。携带这种来源的质粒在大肠杆菌中以高拷贝数存在。

     

    氨苄青素:氨苄青素抗性基因。它允许在大肠杆菌中通过选择氨苄霉素来维持质粒。

     

    代表性矢量设计

    VB ID矢量名称描述

    VB010000-9486rey pRP[Exp]-CMV>EGFP/Puro一种编码由CMV启动子驱动的EGFP:嘌呤霉素抗性融合蛋白的常规质粒。

    VB900120-0467nuf-pRP[Exp]-CAG>DD-Cre一种编码不稳定的Cre重组酶蛋白的常规质粒,该蛋白在甲苄啶(TMP)存在下,在CAG启动子的控制下发挥作用。

    精准遗传学:浏览Cre-lox工具箱

     

    Cre-Lox系统是基因工程中的一种工具,可以精确控制基因表达和基因修饰。该系统由两个主要成分组成:Cre重组酶和loxP位点。在这篇文章中,我们将回顾这两个主要组件,并深入研究它们是如何每天在实验室中应用的。在对系统进行概述后,我们将深入了解系统本身的进展,以及如何使用系统来推进发现。

     

    “导致重组"-“交叉位点(xP1"

     

    Cre重组酶是一种来源于P1噬菌体的酶,在Cre-lox系统中发挥核心作用。首字母缩写Cre起初来源于术语导致重组";然而,今天它也被称为环化重组酶"的缩短。这种酶具有识别被称为loxP位点的特定DNA序列并与之相互作用的特能力。

     

    LoxP位点,简称交叉位点(xP1",是由两个13碱基对的反向和回文重复序列组成的特异性DNA序列,由一个8碱基对核心序列间隔区分隔。Cre是一种位点特异性重组酶,它识别13个碱基对的反向重复序列,核心区的序列赋予Cre-lox系统方向性。当两个loxP位点面向相反方向放置时,Cre重组酶使两个位点之间的DNA片段翻转。相反,当两个loxP位点在同一方向上位于DNA片段的两侧时,Cre重组酶切除位点之间的片段,导致遗传信息的缺失。在基因组的不同位置面对相同方向的成对loxP位点允许易位(图1)。

    Cre-lox系统的特特性使其能够应用于基因工程中的几种技术。Cre-lox系统受欢迎的应用之一是用于生产转基因小鼠。在小鼠中,Cre-lox系统被广泛用作条件基因操作的工具。研究人员将loxP位点战略性地放置在靶基因周围,制造出一种“floxed"基因。然后,在特定启动子的控制下,用表达Cre重组酶的转基因小鼠培育这些小鼠,从而实现基因修饰的空间和时间控制(图2)。当Cre在特定组织或某些发育阶段被激活时,它在loxP位点催化重组,导致靶基因的精确改变。这使得有条件的基因敲除、激活或其他修饰成为可能,以可控和动态的方式深入了解基因功能。小鼠的Cre-lox系统已被证明在理解基因功能、建模疾病和开发高精度的潜在治疗干预措施方面是非常宝贵的。

     

    例如,肿瘤抑制基因p53的条件敲除模型使研究人员能够探索其在维持基因组稳定性和防止不受控制的细胞生长方面的作用。通过Cre-lox技术激活KRAS等致癌基因,可以研究它们对肿瘤发生和发展的特定贡献。PTENBRCA1/BRCA2E-钙粘蛋白等基因的条件性敲除模型提供了对其在各种癌症类型(包括乳腺癌、卵巢癌和结直肠癌)中的作用的深入了解。这些模型通过允许以组织特异性或时间控制的方式靶向操纵特定基因,为揭示癌症发展的复杂分子机制和在临床前测试新的治疗干预措施提供了宝贵的工具。

     

    除了在小鼠系中使用外,Cre-lox系统经常在体外用于受控的遗传操作。这种方法使研究人员能够利用非病毒载体,如含有loxP位点的质粒或DNA构建体,轻松地引入培养的细胞或细胞系。这些loxP侧翼序列可以被工程化以携带感兴趣的基因、报告基因或其他功能元件。随后,可以用表达Cre重组酶的单独构建体转染细胞。细胞内Cre的存在导致loxP位点之间的位点特异性重组,从而产生所需的遗传修饰。

     

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