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    recipe 抗原蛋白 P9 ; 间接 ELISA 试验操作

    发布时间: 2024-02-19  点击次数: 169次

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    抗原蛋白 P9 ; 间接 ELISA

    1 材料与方法

    1. 1 菌株及血清 副鸡禽杆菌 ABC 三个血清型

    的标准株由本实验室保存。Apg A 型菌、B 型菌

    C 型单因子鸡血清和 P9 蛋白抗血清分别由对应

    菌株或抗原人工接种 SPF 鸡制得, 由本实验室制备

    并保存。大肠杆菌 O1O2O78亚型以及流感( AI)

    H9 亚型、新城疫( ND) LaSota ( NDLa) F48

    ( NDf48) 、鸡传染性法氏囊病 ( IBD) 、减蛋综合征

    ( EDS'76) 等禽病病原单因子阳性鸡血清及 SPF

    血清等, 均由本实验室保存或制备, 支原体抗 MG-S6

    株阳性血清购自中国兽医药品监察所。120 份临床

    样本血清采自河北某蛋鸡场 120 日龄鸡, 该鸡群分

    别在 56 日龄和 90 日龄用鸡传染性鼻炎三价灭活疫

    苗进行了免疫。

    红细胞凝集反应用抗原( HA 抗原) : 副鸡禽杆

    A ( Hp8 ) B ( BJ ) C ( 668 ) HA

    抗原, HA 效价均为 1∶ 160; 副鸡禽杆菌 A 型阳性血

    清、B 型阳性血清和 C 型阳性血清, 红细胞凝集抑

    ( HI) 抗体价为 1∶ 80 1∶ 160; 10% 戊二醛固定的

    鸡醛化红细胞, 以及血清稀释液( 0. 1% BSA

    0. 01 mol /L pH 7. 0 PBS) , 以上材料均由本实验

    室制备并保存。

    1. 2 主要试剂和仪器 酶标板为 NUNC 公司产

    品, HP 标记兔抗鸡 IgG 抗体产自 Sigma 公司; TMB

    显色液产自 KPL 公司; 酶标仪( Molecular Devices

    SPECTA MAX190)

    1. 3 方法

    1. 3. 1 抗原蛋白 P9 的制备及纯化 利用生物信息

    学软件 Geneious( Biomatters. Ltd

    , 通 过 对 副 鸡 禽 杆 菌 外 膜 蛋 白

    HMTp210 的基因( GenBank No KJ867497) 筛选分

    析, 选取氨基酸序列从第 1090 1648 的肽段, 命名

    P9, 由华大基因科技( 北京) 服务有限公司进行全

    基因合成并原核表达。通过对 P9 编码基因的 PC

    扩增、与表达载体 pET30a 连接等步骤构建重组表

    达 质 粒 pET30a-P9。 将 pET30a-P9 转 化 BL21

    ( DE3) , 诱导表达后超声裂解上清用镍亲和层析柱

    纯化, 获得纯化的 P9 蛋白。

    1. 3. 2 阴性血清及 P9 蛋白抗血清的制备 重组抗

    原蛋白 P9 MONTANIDE ISA 71 VG 佐剂( SEPPIC

    公司产品) 3 ∶ 7 重 量 比 混 合 乳 化 ( 操作方法见

    SEPPIC 公司产品使用方法介绍) , 使疫苗中抗原蛋

    白终浓度为 20 μg /mL, 所制备的疫苗命名为 vP9

    免疫方法: 42 日龄 SPF 鸡, 分为 2 组, 30 /组。

    其中一组为疫苗免疫组, 分别胸部注射所述 vP9

    0. 5 mL /; 另一组为非免疫对照组。第 1 次免

    疫后间隔 4 周, 对所有免疫组的鸡进行二次免疫, 剂

    量及免疫途径与次免疫相同。所有试验鸡每周

    于翅静脉采血 1 次, 分离血清, - 20 ℃ 保存备用。

    1. 3. 3 间接 ELISA 方法的建立

    1. 3. 3. 1 抗原包被浓度及血清稀释度的选择 采

    用棋盘滴定法, 用 0. 05 mol /L 碳酸盐缓冲液( PBS

    pH 9. 6) 依次按以下比例稀释 P9 抗原( 0. 5 mg /

    mL) : 依次做 501005001 0002 0004 0008 000

    16 000 倍稀释, 包被反应板 100 μL /孔, 横向包被酶

    标板, 4 ℃ 过夜; PBST ( PBS + 1% tween20 pH

    7. 4) 清洗 3 遍后加入封闭液 ( 5% 脱脂乳, PBS

    ) 37 ℃ 封闭 2 h PBST 清洗 3 遍。阳性血清及阴

    性血清 分 别 用 稀 释 液 ( 1% 脱脂乳, PBS 配制)

    1∶ 50 进行倍比稀释( 1∶ 50 1∶ 400) 100 μL /孔, 纵

    向加入封闭后的抗原包被板中, 其余试验步骤均按

    ELISA 方法进行, 试验结果标准副鸡禽杆菌阳性血

    清值 OD450 nm值为 1. 0 左右, 阴性 OD450 nm值设为 0. 1

    左右的范围选择 P /N 值最大为最佳稀释条件。

    1. 3. 3. 2 最佳血清抗体孵育时间筛选 将血清用

    稀释液稀释至相应浓度后加入抗原包被板, 100 μL /

    孔, 分别 37 ℃ 孵育 0. 5 h1 h2 h, 其余试验步骤均

    ELISA 方法进行, 试验结果选择 P /N 值最大为最

    佳孵育时间。

    1. 3. 3. 3 酶标二抗最佳工作浓度及时间确定 完

    成血清孵育并清洗后, 以稀释液分别稀释 HP 标记

    兔抗鸡 IgG 抗体至 1 ∶ 5 0001 ∶ 10 0001 ∶ 20 000

    100 μL /孔, 分别 37 ℃ 孵育 0. 5 h1 h, 其余试验步

    骤均按 ELISA 方法进行, 试验结果选择 P /N 值最大

    为最佳条件。

    1. 3. 3. 4 显色时间确定 酶标二抗孵育结束并清

    洗后, 加入 TMB 显色液, 100 μL /孔, 放置于 37 ℃

    5101520 min 后加入 2 mol /L H2 SO4 终止读

    数, 50 μL /孔。选择 P /N 值最大时最佳显色时间。

    1. 3. 4 临界值的确定 在优化间接 ELISA 的最佳

    条件后, 使用该方法对 30 份阴性血清进行检测, 根

    据检测样品的 OD450 nm 值平均值和标准差设定该间

    ELISA 方法的判定值: !X + 3 s; 待检样品 的

    OD

    450 nm值若大于判定值, 则该样品为阳性, 反之, 则

    判为阴性。

    1. 3. 5 交叉反应性试验 采用标记为 Hp8( A )

    0221( A ) 0083( A ) 0222( B ) BJ( B )

    668( C ) Modesto( C ) 等不同血清型副鸡禽杆

    菌分别单独感染的鸡血清作为待测阳性血清, 未经

    免疫的 SPF 鸡血清为阴性血清, 各个血清样本做 3

    个平行重复测试, 用于评价本方法的交叉反应性。

    1. 3. 6 特异性检验 应用已建立的间接 ELISA

    法, 对常见的大肠杆菌 O1O2O78 株, 流感( AI)

    H9 亚型、新城疫 ( ND) LaSota ( NDla) F48

    ( NDf48) 、减蛋综合征( EDS'76) 、鸡毒支原体 MG-S6

    等禽病病原的阳性血清进行检测, 并以标准副鸡禽

    杆菌阳性血清为阳性对照, 测定 OD450 nm 值, 各个血

    清样本做 3 个平行重复测试, 确定该方法的特异性。

    1. 3. 7 ELISA 方法检测田间血清样品 本试验建

    立的 ELISA 方法, 对所收集的临床免疫鸡血清, 进

    行测定。各个血清样本做 3 个平行重复, 计算 OD

    值, 并依照本试验所设标准判定检测结果。

    1. 3. 8 ELISA 方法与 HI 试验 实验室收集的 120

    份临床样品用 HI 试验进行对比试验, 分别用 3 个血

    清型的 HA 抗原进行检测, 方法如下[7 : 用血清稀释

    液将吸附后的血清作 2 倍系列稀释, 第 1 孔为 1∶ 5

    2 孔为 1∶ 10, 依此类推, 共作 8 个稀释度( 1∶ 5

    1∶ 10 1∶ 20 1∶ 640) , 每孔含有 50 μL 稀释血清。

    在各管中加入 4 HA 单位的 HA 抗原 50 μL, 充分

    混匀后在室温作用 20 min, 然后每管加入 1% 鸡红细

    50 μL, 充分混匀后在室温静置 60 min, 判定结

    果, 以全抑制 HA 的血清最高稀释度为血清的 HI

    效价。若试验血清的 HI 效价≥5, 即判为阳性。

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