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    Glycotech节苷脂的微量分离和纯化方法

    发布时间: 2022-11-05  点击次数: 155次

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    1.节苷脂的微量分离和纯化方法 Stephan Ladisch ~ 儿童国家医学中心癌症和移植生物学中心主任,华盛顿特区2010这种溶剂分配方法允许从小样品和节苷脂浓度低的样品中分离节苷脂,特别是相对于潜在污染蛋白质和其他大分子量物种的浓度。该方法包括三个步骤: (1)制备干式总脂提取物; (2)在二异丙醚/1-丁醇/NaCl 水溶液中对总脂提取物进行分配; (3) Sephadex G-50凝胶排阻色谱法。最终的总节苷脂制剂被冻干并保存在干燥状态。冻干细胞、血浆或组织的总脂提取物。干燥后的总脂提取物在 DIPE/1-丁醇/盐水相和有机相之间的分配。Sephadex G-50凝胶过滤去除含节苷脂水相中的低分子污染物。1.总脂提取 1.总脂提取物: 氯甲醇方案: 1。将样本(细胞、血浆、均质组织)放入适当大小的圆底玻璃管或烧瓶中冻干(30倍组织或血浆体积)2。用玻璃棒将冻干的样品粉碎成细粉。加入氯仿: 甲醇(C: M)1:1(20体积/克湿重组织或细胞,10体积/毫升血浆或血清)。用超声波将固体分散在浴室超声波仪中,用 N2和盖子盖紧橡皮布。(湿萃取,首先加入10卷。搅拌甲醇,然后10伏。氯仿)3。第一次提取18小时。用磁力搅拌,在4 °C 下搅拌。4。每分钟2000转的离心管(750克,10分钟).仔细倾倒全透明的上清液,不要转移任何颗粒物质,并处理下面的每个(6)上清液。第二次提取用新鲜 C: M 1:1的额外原始体积重新提取总固体材料; 使用新鲜溶剂首先冲洗(4)中使用的离心管,然后将这些冲洗在原始提取烧瓶中。提取4小时。在4 °C N2下搅拌,然后像(4)中那样加工第二种提取物。

    6.Rotovap (浴温不高于20-25 °C)(4)(5)的组合上清液的体积减少到组合总体积的1/4。此时过夜冷却至零下25摄氏度以沉淀蛋白质。像上面一样再次离心,恢复透明上清液。定量地将这种浓缩的总脂提取物转移到离心管(# 8142)中,在离心管中进行 DIPE/丁醇分离。保存颗粒直到后的 G-50阶段,以防再加工是必要的。用一股 N2蒸发上清液至干燥,并用冻干法除去残留的溶剂痕迹。注: 第一提取物去除了90% 以上的节苷脂,第二提取物中剩余的10% 与第一提取物没有质的区别,冷却至 -20 °C 时去除的沉淀物中不含节苷脂。使用的 C: M 的体积没有被发现在一个合理的范围内是关键的。我们已经使用了多达10毫升/108细胞(即更高的体积) ,与通常的10-20体积相比,对回收率没有影响。2.DIPE/1-丁醇/盐水分隔

    材料: 二异丙基醚1-丁醇,试剂级双蒸馏去离子水(ddH2O)盐水溶液: 0.1% NaCl 0.3% NaCl1550ml 玻璃锥形离心管,聚四氟乙烯内衬盖(# 8142)方案: 阶段: 有机: 2体积 DIPE/1-丁醇,60:40v/v : 1体积盐水溶液。1% 氯化钠: 109个细胞的总脂提取物10毫升盐水(最小体积为1毫升)。血浆: 对于血浆,使用 ddH2O: 2.0 ml ddH2O/总脂提取物1ml 血浆,最小水溶性容积为1ml。放射标记的细胞节苷脂: 1.0毫升最小体积的生理盐水(使用少至106个细胞)。组织: 对于组织,使用0.3% NaCl: 109个细胞 = 1克组织,因此每克组织使用10毫升生理盐水。注意: 以下程序步骤的细节是至关重要的,必须遵守。一旦开始步骤(1) ,则应立即执行步骤(7)中的程序。在总脂提取物中加入有机(DIPE/1-丁醇)相,旋涡,超声波直到样品全分散。可能会产生乳白色的溶液,但是大颗粒必须在进入(2)之前被分散。加生理盐水。3。执行2分钟。交替涡流与超声波的结合。离心机10分钟。转速为2000(750xg)5。从较低的水相中去除较高的有机相(与水相存在时,留下轻微的界面乳状液)。添加新鲜有机相的原始体积,重复步骤(3)(4)(5)进行第二次分区。注: 随后的节苷脂放射自显影研究有两个分区,需要最高定性纯度的组织和血浆样品最多有三个分区。7。通过用 N2流去除溶剂痕迹,冷冻和冻干,准备最终的水相(含节苷脂)用于下面的 STEP (3)

    3.Sephadex G-50凝胶过滤

    材料:

    葡聚糖凝胶G-50150

    洗脱液:双蒸馏去离子水(ddH2O

    紫外线监测仪和记录仪,在206nm处测量

    协议:

    将样品重新溶解在适当体积的(ddH2O)中,短暂超声以确保胶束形成,并加载有时着色但始终透明的水相。在空隙体积(峰1)中回收节苷脂,然后将其冻干并重新溶解在小体积的C:M 1:1中。离心样品,在清澈上清液中定量回收神经节甙脂。沉淀物含有在总脂质提取步骤中共提取的残余蛋白质。

    参考文献:

    1 LadischS.GillardB.1985)用于微规模节苷脂纯化的溶剂分配方法。分析生物化学146:220-231

    2 LadischS.GillardB.1987)从血浆中分离和纯化节苷脂。《酶学方法》138:300-306

    典型柱条件:

    床体积流速(ML/MIN)最佳(最大)样品装载量装载样品的节苷脂总含量

    10-15毫升0.25 0.30.75-20 80-100%

    40毫升0.6 0.51.520-50 100%

    90毫升1.2 1.53.070-5400 93-100%

     

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