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    Emsdiasum常见问题解答

    发布时间: 2022-11-04  点击次数: 332次

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    Emsdiasum常见问题解答

    我应该使用什么样的粒度?

    始终使用最小的颗粒大小来适合您的应用。基于较小颗粒的共轭比基于较大颗粒的共轭更有效。如果使用较小的粒子难以显示,则可以使用银增强来放大这些粒子,这是Ultra Small系列共轭物的备条件。新的银增强系统AURION SE-EM提供均匀高效的增强。

    金缀合物真的比其他缀合物更倾向于背景吗?

    不这个童话故事来源于这样一个事实,即金共轭物是基于粒子的,而可视化也是基于单独的粒子的。与酶和荧光标记相反,金缀合物更像一个数字系统,要么它们在那里,然后你会看到它们,要么它们不存在。酶和荧光标记很快被认为是类似物"标记,它们在检测中的可见度随着其局部浓度或酶标记产生可见反应产物的时间而增加。对荧光对照的无偏见观察显示,生物化合物中存在双键所固有的低水平光,最重要的是来自标记抗体的荧光。同样,对仅用碱性磷酸酶或过氧化物酶标记的抗体孵育的对照样品进行无偏见的观察,通常会显示出样品的整体染色微弱。这种微弱的水平很容易被接受,甚至在心理上被过滤掉。你不能用金共轭物做这件事,因为它们是基于粒子的。

    我应该使用二级金缀合物或蛋白a(或G)吗?

    这取决于你的目标是什么。使用次级缀合物会产生更高的标记密度。因此,人们常说次级缀合物比蛋白A缀合物更敏感。这在一定程度上是正确的。蛋白质A(或G)仅识别一级抗体分子上的一个位点。只有当此站点可用且不被其环境遮挡时,才会发生绑定。次级缀合物识别初级上更多的位点,因此检测到初级抗体的可能性更大。本质上,这是灵敏度的提高。

    有没有免疫金(银)染色的培训计划,我可以自己带标本?

    EMSAurion组织湿式工作坊,您最好使用自己的样本和初级抗体。毕竟,这就是你的兴趣所在。如果需要,我们将把活动扩展到其他场地。研讨会持续两三天,对免疫金(银)染色进行了深入探讨。参与者人数有限,以保证最佳教学。您可以直接联系我们了解更多信息。有关我们研讨会设置的详细信息,请访问本网站。

    有可能对细胞内抗原进行预包埋标记吗?

    对单细胞是最合适的。植物材料有一层厚厚的不可穿透的墙,而不是。超小型金缀合物是选的缀合物。在许多情况下,NaBH4的渗透步骤足以打开样品并允许试剂渗透。低浓度的温和清洁剂,如皂苷,有助于清洁。需要强调的一点是:必须延长反应时间,因为必须实现试剂对内部抗原的全渗透。为了在孵育后去除未反应的试剂,必须同样调整洗涤程序!《Aurion通讯》第5期讨论了这个话题。请参阅本网站的其他地方。

    如何验证我的缀合物是否仍然有效?

    有一个简单的程序来检查这一点。它在Aurion的通讯#4中有非常详细的描述,一些信息可以在本网站的通讯"部分找到。简而言之:你需要一个硝基纤维素条,从一级抗体的稀释系列中涂上点,然后用金试剂孵育条。这些点会被较大的共轭物染成红色。测试超小型共轭银时,必须应用银增强进行可视化。

    如何验证银增强试剂是否仍然正常?

    同样,有一个简单的过程来检查这一点。它在我们的第4号通讯中有详细描述(请参阅本网站的通讯"部分)。简言之:你需要一个硝基纤维素条,从你的金缀合物的稀释系列中涂上点,然后用银增强试剂孵育条。圆点应变成棕黑色。在这段时间内,试剂混合物应保持玻璃透明,无任何由自成核引起的可见银存在。

    电子显微镜用银增强试剂SE-EM的活性可以通过向100µl增强混合物中加入10µl稀释的超小型试剂来测试。溶液应在30-45分钟内变黄。

    建议使用过时的共轭词吗?

    只要它们的反应性良好,并且没有形成太多的团簇,这就没有问题。金共轭物非常稳定。随着时间的推移,可能会有一些蛋白质从颗粒表面释放,但通常这不会导致反应性显著降低。如通讯#4所述,结合物的反应性很容易通过点点测试进行检查。根据结合蛋白的类型和颗粒大小,簇的形成可能会随着时间的推移而增加。粒子越大,簇越多。这些可以在使用前通过离心稀释的缀合物来去除。

    是否可以使用来自同一动物源的两种抗体进行双重标记?

    是的,有办法做到这一点。一种是通过使用具有不同粒径的蛋白G或蛋白A缀合物。程序是:首先用一级抗体I孵育,用粒径较小的蛋白A(或G)检测。然后加入过量游离蛋白AG50-100µG/ml)孵育。这将几乎阻断蛋白AG的所有结合位点。接下来,用一级抗体II孵育第二种抗原,并用更大尺寸的AG蛋白金缀合物检测。第二种可能性是用一级抗体的混合物进行一步孵育,每个抗体直接用不同的金粒径标记。可提供定制标签服务。

    我应该使用什么样的网格进行银色增强?

    镍是选材料。黄金网格是不可能的,因为它们也将被整齐地增强。铜也是如此。无论如何,镍网格比铜网格更适合免疫培养,因为镍对免疫或酶反应更具惰性,毒性更小。镍网格由于其磁性而令人讨厌。通过使用非磁性镊子或使用电子显微镜科学美回路"在免疫培养期间将网格从液滴转移到液滴,可以很容易地克服这一问题。

    银增强和OsO4怎么样?

    OsO4固定可在孵育前、孵育后或银增强后使用。

    由于其对抗原OsO4的破坏作用,当打算进行免疫培养时,通常不使用固定。然而,一般来说,银增强免疫孵育的OsO4固定标本不会造成任何困难。

    孵育后可引入锇固定步骤,以提高样品的对比度。如前所述,应用银增强通常不会造成任何困难。

    增强后使用OsO4固定也是可能的,但由于OsO5是一种强氧化剂,它能够氧化金属银,特别是当以颗粒形式存在时。这导致部分银被去除。一种简单的补救方法是将稍微增强的样品与有限的OsO4固定相结合,例如1%OsO5分钟。

    我没有得到积极的结果,现在怎么办?

    当孵育的标本看起来和对照一样干净时,要么(一种或多种)试剂不活跃,要么抗原被破坏、掩盖或缺失。如通讯#4(请参阅本网站的通讯"部分)中所述,通过使用点点测试反向进行孵化协议测试,很容易找到原因。

    首先测试所用金缀合物上的银增强试剂(如果使用的话)的活性。如果银增强是好的,下一步是在使用的一级抗体上测试金缀合物,等等。如果它证明问题不在试剂中,你将不得不研究抗原保存。是否应进行不同的固定?或者不同的嵌入介质?使用光显微镜对结果进行评估,无需繁琐的EM实验工作即可回答这些问题。

    我有背景问题;这是因为金共轭吗?

    当标本被正确阻断并且使用了正确的培养缓冲液成分和条件时,背景水平不应干扰特定信号。某些背景总是存在的:在某种程度上,所有化合物对其他化合物都有一定的亲和力,根据可用性和浓度,可能会发生相互作用。在这方面没有绝对的黑白之分。

    当你放弃了一级抗体培养,只使用黄金步骤,而你的背景已经大大降低,那么你的一级抗体就会导致背景。补救措施:通过亲和层析(抗血清)和/或交叉吸附纯化一级抗体。如果在不使用初级培养的情况下,你的背景水平不可接受,那么样本有可能与金缀合物结合。

    背景可能有许多原因,围绕三种不同类型的相互作用:

    通过在蛋白质阻断步骤之前使用NaBH4或氨酸阻断步骤消除的残余固定活性,

    对疏水区域的粘性(包埋介质、富含脂质的样品化合物)。这通过使用适当的蛋白质阻断步骤来减少,所述蛋白质阻断步骤涉及部分疏水性蛋白质,

    基于电荷的相互作用导致带负电荷的试剂(如抗体和金缀合物)粘附在样品中带相反电荷的区域(臭名昭著的是组蛋白、一些胶原类型和聚赖氨酸,有时用于使切片粘在表面)。这种类型的相互作用只能通过向培养基中添加过量的带负电荷的无关分子来克服。Aurion开发了一种化学修饰的BSA,称为BSA-c™ 特别是为此目的。通讯#1提供了深入的信息。新闻稿可在此处在线获取。

    有什么论坛我可以回答关于标签或显微镜的问题吗?

    请随时通过电子邮件联系我们的帮助台,关于免疫标记的问题。

    有一些新闻组可能感兴趣,如:生物网。细胞生物、生物网、细胞生物。细胞网,bionet.molbio。方法采用免疫细胞化学和生物化学方法。有一个显微镜ListServer,您可以订阅它,它提供了一个平台,可以从各个方面询问有关光学和电子显微镜的问题。您可以通过向发送电子邮件进行订阅该消息只需包含订阅显微镜"一词。

     

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