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    Glycotech 平行板流室中的动态流动测定

    发布时间: 2022-09-20  点击次数: 169次

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    Glycotech 合成碳水化合物聚合物和探针

    吨在许多情况下,功能性碳水化合物结构的研究需要用报告基团衍生分子以进行检测,并以具有生物学意义的多价形式呈现。以下部分包含合成碳水化合物探针,其中碳水化合物被掺入聚丙烯酰胺基质中,从而产生 30kd 多价聚合物。除非另有说明,否则聚合物链的大约每 5 个酰胺基团以 4:1 的比例被N 取代,而其他的则以 20:1 的比例含有荧光素。多价聚合物可与链霉亲和素报告试剂一起用于酶免疫测定、与其他荧光基团偶联或固定在固体支持物上。在不需要多价的情况下,也可以使用单价化探针。在最后一组中,可以使用含有不同摩尔比并因此具有不同碳水化合物基团密度的聚合物组。虽然这些探针涵盖了广泛的碳水化合物序列,但可根据要求定制合成特定的碳水化合物聚合物。

    Glycotech 平行板流室中的动态流动测定

    John T. Patton~GlycoTech Corporation, 罗克维尔, 马里兰 20850

    F low 测定允许在明确的壁剪切应力下可视化细胞粘附。细胞粘附的不同事件的可视化可以通过选择性图像采集和随后的图像处理来量化。流动测定特别适用于研究在比大多数静态粘附测定更短的时间尺度内非常迅速地发生的粘附事件。此外,可以研究初始事件之后的事件,例如细胞稳定和扩散,从而深入了解特定细胞-细胞或细胞-基质粘附行为的动力学。

    材料:

    显微镜:

    配置用于相差和荧光操作的倒置显微镜

    物镜(6.3 x10 x40 x

    舞台孵化器

    生物:

    细胞悬液(中性粒细胞、癌细胞)

    35 mm 培养皿中的细胞单层或涂层基质

    粘附培养基(不含血清的培养基,含 12 mM Hepes

    纤连蛋白(人血浆)

    牛血清白蛋白 (BSA)

    流室系统:

    带垫圈和管接头的流动室甲板

    35 mm 组织培养皿

    哈佛注射泵

    安装在泵上的玻璃注射器(3520 60 cc

    硅胶管

    旋塞阀

    真空泵

    电脑/电子:

    数字图像采集处理系统

    显示器

    录像机

    带控制器的CCD相机

    时间日期生成器

    具有图像系统接口的计算机

     

    图像存储设备

    协议:

    细胞单层制备

    1. 在每个培养皿中加入 1 ml 5.5µg/ml FN 溶液,用人纤连蛋白 (FN) 涂抹培养皿。

    2. 孵育 30 分钟。在室温下。

    3. 从每个盘子中吸出溶液。

    4.根据达到汇合所需的时间,以0.5-3.0 x 10 5 个细胞/ml的接种密度向每个培养皿中加入 2 ml 细胞悬浮液(HuvecsCHO 细胞)

    5. 1-5 天后,在流式分析中使用具有融合单层的培养皿。每 2-3 天喂一次细胞,但通常不是 48 小时。的流量测定。

    涂层基材制备

    1. 用记号笔在每个培养皿的中心画出一个涂层区域(直径 5 毫米),用于涂层基材。

    2. 20μl 含底物的溶液(浓度为 10μg/ml)加入涂层区域。孵育 1 小时。

    3. 吸出液体,加入 20µl 1% BSA 封闭 1 小时。

    4. 吸出 BSA,加入 20µl 抑制剂 1 小时。

    5. 培养皿已准备好用于流式分析。

    使用平行板流动室进行流动分析

    1. 打开载物台培养箱,将粘附介质加热至 37°C 1 小时。在开始流动测定之前。

    2. 组装将入口、出口和真空管线连接到流动室甲板的流动系统装置。用介质填充系统并清除系统中的所有空气。

    3. 用细胞悬液填充入口容器。对于使用细胞单层的测定,建议使用 10 6 细胞/ml。对于涂层底物检测,使用 10 5 个细胞/ml

    4. 将培养皿倒置,将培养皿固定到流动室培养皿上,在流路区域放置一小团培养基,然后将 35 mm 培养皿放在培养皿上。真空将盘子放在甲板上。确保盘子附在流动路径中没有气泡。

    5. 将组装好的腔体放在显微镜台上。

    6. 0.1-4.0 达因/cm 2范围内的剪切应力启动连接到出口流动室的细胞注射泵流动。

    7. 让细胞流动足够的时间以获得足够数量的细胞与细胞单层或涂层表面相互作用。一般3-10分钟。用来。

    8. 开始图像采集。在盘子上的 7-10 个位置收集图像。通常,在给定的实验条件下,3 道菜提供了足够的数据来显示处理之间的统计差异。

    9. 在所有培养皿上采集图像后,进行图像分析以量化流动测定。

    参考:

    (1) Lawrence, MB, McIntire, LV, Eskin, SK, (1987),流动对多形核白细胞/内皮细胞粘附的影响,血液701284-1290

    (2) Patton, JT, Menter, DG, Benson, DM, Nicolson, GL, McIntire, LV, (1993),在平行板室中流动的肿瘤细胞的计算机分析以确定它们的粘附稳定滞后时间、细胞运动性和细胞骨架2688-98

    (3) Jones, DA, Abbassi, O., McIntire, LV, McEver, RP, Smith, CW, (1993)P-选择素介导嗜中性粒细胞在组胺刺激的内皮细胞上滚动,生物物理学杂志651560-1569

     

     

     

     

     

     

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