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Biotium福建代理
产品时间:2021-11-25
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什么是细胞外囊泡?

细胞外囊泡 (EV) 是由细胞分泌的膜结合小颗粒,被认为具有细胞信使的功能,将货物从一个细胞运送到另一个细胞。电动汽车有多种亚型,其功能、货物和尺寸各不相同,直径范围为 ~30-1000 nm。最小的 EV 类型是外泌体,大小约为 30-150 nmEV 起源于称为多泡体 (MVB) 的细胞区室,其本身源自内体的内陷。当 MVB 与质膜融合并释放其货物时,囊泡被释放。

 

在生物医学研究中,外泌体及其货物被用作癌症和其他疾病的诊断生物标志物。EV 和外泌体可以使用超速离心、PEG 沉淀和免疫捕获珠等技术从血液或其他生物体液中分离出来。

 

外泌体膜含有源自原始细胞质膜的跨膜蛋白,通常包括四跨膜蛋白家族的蛋白质(如 CD9CD63 CD81)。在内部,外泌体包含细胞质成分,如蛋白质和 RNA。可以使用 RNAseq、蛋白质印迹和流式细胞术等方法分析外泌体成分。为了通过流式细胞术进行表征,研究人员可以使用染料对膜和核酸等外泌体成分进行染色,以及与四跨膜蛋白或其他感兴趣的蛋白质结合的抗体。

外泌体分析:小目标,大挑战

外泌体的小尺寸使其难以处理和分析。在流式细胞术中,外泌体很难与细胞碎片和其他小颗粒区分开来,它们的大小处于或低于某些流式细胞仪的灵敏度极限。用某些染料或抗体染色有助于区分外泌体和其他颗粒。然而,使用不会形成聚集体的染色剂很重要,因为这些小颗粒本身可能会与染色的外泌体混淆。这种聚集体一直是外泌体研究人员的挫败感。

 

在分析之前用于富集或纯化 EV 的方法也是一个重要因素。富含简单 PEG 沉淀步骤的样品通常含有大量非 EV 脂质颗粒,这些颗粒也可能与膜染料结合。这些杂质可以通过使用其他 EV 纯化方法来减少,例如尺寸排阻色谱 (SEC) 或免疫沉淀。与抗四跨膜蛋白抗体结合的磁珠可以产生纯外泌体簇。然而,这些珠子可能会与许多疏水性染料(例如膜染料)非特异性结合。

 

我们已经筛选了大量我们的抗体和染料,以寻找那些既能很好地染色外泌体,又表现出极少或没有聚集(即在没有外泌体的情况下发出信号)的抗体和染料。继续阅读下文,探索我们经过验证的 EV 抗体和染料。

EXOBRITE™ EV 膜染色试剂盒

ExoBrite™ EV 膜染色试剂盒旨在克服外泌体检测的一些挑战。ExoBrite™ 染料与外泌体膜中的分子结合,通过流式细胞术为分离的 EV 提供明亮、特异性的染色。ExoBrite™ 染料的一个关键优势在于,与许多其他染料不同,它们几乎没有或没有与外泌体或 EV 大小相似的背景聚集体。此外,与大多数膜染料不同,ExoBrite™ 染料不会非特异性结合聚苯乙烯珠粒,这意味着它们可用于染色珠粒结合的外泌体。

 

ExoBrite™ EV 膜染色剂已在流式细胞术中得到验证,能够对来自多种不同培养细胞系的外泌体和 EV 进行染色,并通过多种不同方法进行分离,包括尺寸排阻色谱 (SEC)、聚乙二醇 (PEG) 沉淀和磁珠免疫沉淀 (IP)

 

ExoBrite™ EV 膜染色优点:

 

专为外泌体染色设计和配制

极低的背景可提供出色的信噪比

能够与抗体共同染色(不同于 CellBrite® Fix MemBrite® Fix

能够与珠结合外泌体一起使用(与大多数其他膜染料不同)

 

来自 MCF-7 细胞的珠结合外泌体的流式细胞术。未染色的外泌体(灰色)或与 10X ExoBrite™ 490/515 CD9(H19a)-CF®568(粉色)共染色。在 FITC R-PE 通道中的 CytoFLEX LX 流式细胞仪上检测到外泌体。

ExoBrite™ EV 膜染色/抗体共染色

ExoBrite™ EV 膜染色剂的一项优势是能够与抗体共染色,用于外泌体蛋白质分析研究。共染色可以同时或顺序进行,并且可以在纯化的或珠结合的外泌体上进行。ExoBrite™ EV 膜染色剂是通用外泌体染色剂,应标记样品中的所有外泌体*,允许使用抗体来量化表达目标蛋白质的外泌体数量。例如,在我们测试的外泌体(MCF-7 衍生)中,四跨膜蛋白 CD9 高度且无处不在地表达。** 我们发现,当我们与 ExoBrite™ 560/585 EV Membrane Stain CD9 H19a)-CF®488A,它们的阳性群体几乎完全重叠(见图,右)。

 

纯化外泌体最佳 ExoBrite™/抗体共染色的提示:

 

使用 10X ExoBrite™ 1 mL 中纯化的外泌体进行染色(ExoBrite™ 染色在同时共染色期间会有所减少,因此不建议使用 1X

尝试从至少 0.1 ug/mL 的抗体开始

*在我们测试的外泌体中,ExoBrite™ EV 膜染色剂标记了所有外泌体。可能存在具有不同染色水平的外泌体类型。

 

**四跨膜蛋白(CD9CD61 CD81)和其他蛋白质的表达水平在细胞类型和外泌体来源之间差异很大。

SEC 纯化的 MCF-7 衍生外泌体同时使用 1 mL 10X ExoBrite™ 560/585 EV Membrane Stain 0.1 ug/mL CD9(H19a)-CF®488A 染色。当对 ExoBrite™ 560/585 阳性颗粒进行门控时,约 95% CD9 也呈阳性(顶行)。同样,当对 CD9 阳性颗粒进行门控时,约 95% ExoBrite™ 560/585 也呈阳性(底行)

经验证的外泌体抗体

用作外泌体标志物的最常见蛋白质是四跨膜蛋白家族的成员 CD9CD63 CD81。四跨膜蛋白是具有许多拟议功能的质膜蛋白,包括其他膜蛋白的活化和分选。它们还被认为在将蛋白质靶向多泡体 (MVB) 和外泌体方面发挥作用。这些四跨膜蛋白在许多细胞类型上广泛表达,因此可以在许多类型的外泌体上检测到,但它们的表达水平确实因细胞来源类型而异。

 

EV 中经常检测到的其他蛋白质包括热休克蛋白(即 HSP70)、膜运输蛋白、MVB 生物发生蛋白(即 AlixTSG101)和细胞粘附分子(即 Ep-CAMICAM-1)。Ep-CAM 主要在上皮细胞中表达,包括细胞系 MCF-7

 

Biotium 提供多种不同的针对外泌体标记蛋白的抗体克隆,每种都有多种偶联物选择,例如亮 CF® 染料和生物素。下面列出的抗体已通过流式细胞术专门验证用于外泌体检测,使用富集的 MCF-7 衍生的 EV,结合 CD63 特异性磁珠 (Thermo Fisher Scientific)

 

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