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Goldbio江西代理
产品时间:2021-11-25
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RNA 在调控和基因表达中起重要作用,并在植物生长发育过程中发挥作用。因此,获得充足且高质量的植物RNA产量对许多生物科学领域至关重要。

植物 RNA 的几个特征使其提取具有挑战性。在本文中,我们将讨论这些特征、RNA 的类型、植物 RNA 提取的主要步骤、如何量化产量和验证植物 RNA 的质量,以及更好地提取植物 RNA 的一些技巧。

什么是RNA

RNA是分子核糖核酸的缩写。RNA是每个生物体非常重要的分子。它由四种类型的核糖核苷酸碱基组成,称为腺嘌呤 (A)、胞嘧啶 (C)、鸟嘌呤 (G) 和尿嘧啶 (U)。有时,将 RNA 比作参考书上的副本(在这种情况下来自 DNA)。

 

RNA 是单链分子,含有核糖(而不是 DNA 中存在的脱氧核糖)。核糖含有用 OH 表示的羟基。这些羟基使 RNA 更具反应性并易于水解,从而导致分子不稳定并使其更容易降解。由于其不稳定性,操作 RNA 时必须更加小心。

RNA的类型

在植物中,您可以识别三种主要类型的 RNA

 

信使 RNA (mRNA):一种转录 DNA 序列并编码蛋白质或调节产物的分子。

核糖体 RNA (rRNA):这种 RNA 是核糖体结构的一部分,对所有生物体的蛋白质合成至关重要。rRNA 构成了核糖体中的主要物质,按重量计大约为 60% rRNA 40% 的蛋白质。

转移 RNA (tRNA):这种类型的 RNA 分子将 mRNA 序列解码为蛋白质。tRNA 在翻译(从 mRNA 分子合成蛋白质的过程)期间在核糖体的特定位点发挥作用。

这三类RNA在每个细胞中所占的比例各不相同:mRNA约占总RNA2.0-2.5%tRNA约占14%,而绝大多数被rRNA占据(约80%)。正如您稍后将看到的,这些比例在确定 RNA 提取的质量方面起着重要作用。

除了上面列出的 RNA,研究人员还在植物和动物中发现了许多其他类型的 RNA

此外,还有一些 RNA 仅对植物具有特异性,例如叶绿体 RNA

 

与在线粒体中发现 RNA 的方式类似,叶绿体中也存在 RNA。这些细胞器(线粒体和叶绿体)中的 RNA 由内共生理论解释。该理论指出,真核细胞中的线粒体和叶绿体曾经是被大型厌氧细菌摄取的需氧细菌。因此,植物具有三种完全不同的 RNA:核、线粒体和叶绿体。

 

 

为什么提取植物RNA这么难?

植物 RNA 的问题在于提取通常会产生较低的 RNA 质量和产量。

 

您可能知道,植物的细胞中有很多代谢物。它们含有蛋白质、脂质、多糖和次生代谢物,仅举几例。

 

由于裂解步骤,所有这些代谢物在 RNA 提取过程中都变得混合,在此过程中必须破坏植物膜以释放 RNA

 

分离好的 RNA 的困难在于这些代谢物的大量存在。它们在结构上类似于核酸并与 RNA 共沉淀,从而降低了提取的产量和质量。此外,氧化多酚(作为醌)等次级代谢物不可逆地与核酸结合并作为下游应用的抑制剂或可能降解 RNA

 

使植物 RNA 提取更加困难的其他一些条件包括:许多植物样品中固有的高水平 RNases(降解 RNA)、低浓度的 RNA(由于含水量高)和纤维组织,如木质素(木材) 难以分解和移除。

 

同样,分离高质量的 RNA 对下游应用至关重要。

植物RNA的应用

RNA 在许多不同的技术中非常有用,可以理解基因调控和表达。RNA 用于传统应用,例如:

 

逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)

定量 RT-PCR (RT-qPCR)

互补 DNA 合成 (cDNA)

Northern印迹

对于高级方法,RNA 用于:

 

差分显示 (DD)

抑制消减杂交 (SSH) 文库构建

RNA-Seq(研究特定条件下生物体中存在的所有RNA的转录组或集合)

染色质免疫沉淀

新一代测序 (ChIP-Seq) 实验。

 

植物RNA的提取方法

已经发布了数以千计的植物 RNA 提取方案。但是,大多数报告的协议都基于三种方法:

 

基于苯酚的方法:基于苯酚的方案主要用于具有高浓度次生代谢物的植物。苯酚通常与氯仿结合以去除多糖污染物。

基于 Trizol 的方法: Trizol 已被用于从特定组织(如拟南芥种子)中提取 RNA Trizol 是一种市售试剂,它在单一溶液中结合了苯酚和异硫氰酸胍,以便在快速分离过程中产生高产量的 RNA。在该方法中,trizol 与氯仿、异丙醇和乙醇在无 RNase 的水中结合以去除污染物。

基于 CTAB 的方法:十六烷基基溴化铵或基于 CTAB 的方法已用于具有高多糖、次级产物或高水平 RNase 的植物样品。CTAB 提取缓冲液基本上由 2% 十六烷基基溴化铵、1% 聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)100mM Tris-HCl1.4M NaCl 20mM EDTA 组成。这种方法首先去除多糖,然后是蛋白质,最后是次生代谢物。该方法还可以包括浓度约为 0.5% 的十二烷基硫酸钠 (SDS)SDS 是一种去污剂,可与蛋白质形成复合物,有助于在提取过程中去除蛋白质污染物。

 

 

植物RNA提取的主要步骤

大多数 RNA 提取可以分为四个步骤:

 

均质化:可以新鲜或冷冻获得组织。此外,当没有合适的实验室条件时(如从现场工作中收获),样品可能会保存在高盐溶液中,如“RNA 后期试剂"(室温),直到在实验室中处理。使用新鲜或冷冻组织没有一般规则,因为要求取决于实验和植物组织。然而,一旦样品准备好,它通常被放置在研钵中,并在研杵的帮助下,在加入缓冲提取溶液之前将组织研磨成细粉。在其他情况下,研究人员可以使用带有珠子的均质器,这有助于将组织粉碎成粉末。

分离:一旦组织变成细粉,加入缓冲液提取液。在这种情况下,可以使用任何苯酚、trizol CTAB 缓冲液提取溶液。此步骤的目的是裂解细胞以释放 RNA。然而,这是关于污染的关键步骤,因为当膜破裂时,所有细胞内容物都会同时释放。这意味着 RNA 与所有其他细胞成分结合,多糖和多酚等代谢物现在可以与 RNA 更紧密地接触。同时,RNAses 也开始工作,从而增加了 RNA 降解的风险。一些提取溶液的作用类似于 RNA 酶抑制剂,可减少 RNA 损伤的机会。

清除:在此步骤中,使用不同的互补试剂去除污染物,例如多糖、蛋白质和次级代谢物,以及其他可能的污染物。氯仿和异丙醇等试剂分别用于去除多糖/二级代谢物和蛋白质。此外,污染的基因组 DNA 可以使用基于柱的或基于酶的方法去除。

沉淀:此步骤用于纯化和清洁下游应用最终溶液中的 RNA,并进一步去除任何额外的污染物。在这里,乙醇 70%、用 0.1% (v/v) 焦碳酸二乙酯 (DEPC) 或无 DNase 和无 RNase 的水处理的水可用于保存提取的 RNA。最后,一旦 RNA 溶解在这些试剂之一中,RNA 必须储存在 -80°C

植物RNA提取的关键试剂

尽管在 RNA 中使用了许多解决方案,但在本文中,我们选择了六种对大多数 RNA 提取协议非常重要的试剂/解决方案。

 

裂解缓冲液:这是为了打破细胞膜并促进 RNA 的释放。这通常是 Trizol、苯酚或 CTAB 缓冲液。

氯仿:这是一种通常用于去除多糖的试剂。一些协议建议使用氯仿进行两次洗涤以获得更好的结果。

异丙醇:该试剂有助于去除蛋白质。

乙醇:该试剂用于沉淀步骤。通常,RNA 70% 乙醇中沉淀。

RNase DNase 水:这些用于 RNA 协议所需的所有解决方案。此外,这种类型的水可以在市场上买到,也可以用 DEPC 处理过的水代替。DEPC 处理过的水是通过将一定体积的蒸馏水与 DEPC 试剂 (0.1% v/v) 混合来制备的。

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