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甲基化特异性MLPA
产品时间：2025-06-26
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甲基化特异性MLPA
(MS-MLPA) 是SALSA® MLPA®技术的一种变体。通过MS-MLPA，可以同时对多个目标进行半定量的甲基化分析。
MS-MLPA 探针
如同常规MLPA探针混合物，MS-MLPA探针混合物包含靶向特定基因组序列的探针。每个探针由两部分组成：左探针寡核苷酸（LPO）和右探针寡核苷酸（RPO）。MS-MLPA探针混合物中的某些探针靶向包含甲基化敏感性HhaI内切酶限制位点的区域。这些探针可用于甲基化分析。
MS-MLPA 的原理
探针与样品DNA上的目标序列杂交。然后使用HhaI酶消化未甲基化的双链探针-DNA复合物。
与未甲基化样本DNA形成的复合物被消化。消化后的探针无法呈指数级扩增，因此不会产生信号。与甲基化样本DNA形成的复合物不被HhaI消化，并将产生正常信号。
MS-MLPA 反应
MS-MLPA 的步骤与MLPA的步骤非常相似。最重要的区别是反应在过夜杂交后被分为未消化和已消化的反应。
未消化的反应用于拷贝数测定。在消化的反应中，用于甲基化分析，HhaI酶与Ligase-65酶同时加入。
数据分析
用于分析数据。拷贝数与常规 MLPA 一样，通过未消化反应来确定。DNA 样本中的甲基化百分比是通过将消化反应中的每个探针信号与未消化反应中的相应信号进行比较来确定的。
完成
对您的MLPA数据进行完整分析。
质量
对您的样品和实验进行严格的质控。
新的
免费访问最新的Coffalyser表格。
是 免费、用户友好型 MLPA 分析软件，由 MRC Holland 开发和支持，帮助您充分利用您的数据。
Coffalyser 已在欧洲和以色列注册用于体外诊断（IVD）用途*。
* 欧盟（候选）成员国、欧洲自由贸易联盟（EFTA）成员和英国。
高级质量控制
一个专为MLPA设计的高级质量检查系统帮助您评估从片段分离的质量和MLPA反应到参考样品的再现性的一切内容。这些检查有助于防止您基于不良数据得出结论，并提升您对结果可靠性的信心。
可视化您的数据的所有方面
Coffalyser 允许您以多种方式可视化和分析您的数据。您可以查看电泳图、表格，或者关注带有拷贝数比率的图表。对于更复杂的病例和故障排除，您可以查看中间分析步骤的结果。要讨论或存储您的结果，您可以将总结导出为 PDF。
获取最新信息
关于我们的产品的最新信息可以直接从Coffalyser内部从我们的服务器获取。这确保了您在收到新产品后即可开始分析。Coffalyser的更新始终是免费的，确保您始终从最新的见解中受益。
免费支持
我们全力支持Coffalyser。我们总是很乐意回答您关于如何使用该软件的问题，并帮助您解决困难数据。
门指南
要开始使用，请通过您的免费账户生成一个免费的许可证密钥并下载Coffalyser。有关安装帮助，请参阅我们的安装手册。有关如何开始进行次分析的信息，请参阅参考手册。
# 附录I-标准化和结果解释
MLPA是一种基于探针信号相对变化分析的相对技术。MLPA探针的绝对荧光信号强度（由毛细管电泳仪测量）在用于数据分析之前需要进行标准化。
标准化
拷贝数分析
Coffalyser使用一系列标准化步骤和计算来计算最终探针比率。在称为内部标准化的过程中，Coffalyser通过将探针信号与一个样本中的参考探针信号进行标准化，将绝对信号强度转换为相对值。这对每个样本都进行。在相互标准化期间，Coffalyser将每个样本与参考样本进行比较。
标准化过程的简化版本如下：
步骤1
将样本1中目标探针1（Tp1）的信号强度除以参考探针1（Rp1）的信号强度。在参考样本1中进行相同操作。然后将第一个值除以第二个值。
这对探针混合物中包含的每个参考探针都进行。这导致目标探针1的中间比率数量与探针混合物中的参考探针数量相同。接下来，取这些中间比率的中值。见下面的等式。
步骤2
使用分析中包含的每个参考样本重复步骤1。这导致样本1中目标探针1的中值数量与分析中的参考样本数量相同。
Coffalyser然后计算这些中值的平均值。这产生样本1中目标探针1的最终比率。
这个过程对所有探针重复（除了突变特异性探针和信号非常低的探针，见第34页的“最终比率与内部比率百分比"部分）。
分析中未定义参考样本
当分析中未定义参考样本时，所有样本都用于标准化。这将导致一个探针的中值数量与样本数量相同。这些中值的中值是样本中一个探针的最终比率。这个过程对所有探针和样本重复。
更多信息
Coffalyser中用于MLPA数据标准化的确切程序和算法已由Coffalyser的开发人员描述（Jordy Coffa和Joost van den Berg（2011）。MRC-Holland的新型软件Coffalyser分析MLPA数据，《现代质量控制方法》，Ahmed Badr Eldin博士（编辑），InTech，
甲基化特异性MLPA分析
MS-MLPA数据的分析分为两部分。第一部分通过将未消化的患者样本标准化为未消化的参考样本来确定拷贝数，就像拷贝数分析一样。第二部分确定样本的甲基化状态。这通过将消化样本与其未消化的对应物进行比较来完成。
简化来说，标准化的第二部分工作如下：
将消化样本1中目标探针1（Tp1）的信号强度除以参考探针1（Rp1）的信号强度。在未消化样本1中进行相同操作。然后将第一个值除以第二个值。
这对探针混合物中包含的每个参考探针都进行，这将导致目标探针1的中间比率数量与探针混合物中的参考探针数量相同。接下来，取这些中间比率的中值。见下面的等式。
这个过程对所有探针重复（除了突变特异性探针和信号非常低的探针，见第34页的“最终比率与内部比率百分比"部分）。
结果和解释
重要提示：
以下结果应始终在大小调用峰图和/或原始运行数据中目视确认：
- 纯合缺失
- 单个探针缺失和增益
- MS-MLPA结果
- 镶嵌现象
- 异常和意外结果
建议也目视确认其他结果，但这不是必需的。
拷贝数分析
95%置信区间
除了计算探针比率外，Coffalyser还使用统计数据来确定结果是否可靠。为此，它为每个探针计算参考样本的95%置信区间。这表示在100个参考样本中，预计有95个样本的探针比率落在该范围内。参考样本上探针的95%置信区间在比率图中描绘为彩色条（见图1）。
此外，它还为样本中的每个探针计算95%置信区间估计。这表示在100次对该样本的实验中，预计有95次实验的探针比率落在该范围内。样本中探针的95%置信区间在比率图中描绘为围绕计算的探针比率的误差条，该比率表示为一个点（见图2）。
当这两个95%置信区间不重叠时，可以高度确定地得出样本中的结果与参考样本显著不同的结论。如果存在重叠，结果不太明确，因此不能得出结果与参考样本不同的结论。
任意边界
Coffalyser还在比率图中显示任意边界，为红色（下任意边界）和蓝色（上任意边界）线。默认情况下，边界设置为参考样本上探针平均值的±0.3（在比率图中用黄色“x"表示）。例如，当参考样本上探针的平均值为0.95时，下任意边界设置为0.65（0.95-0.3），上任意边界设置为1.25（0.95+0.3）。由于参考样本上探针的平均值对于每个探针都是不同的（并非所有探针的比率都是1），因此任意边界不是直线。
当探针比率跨越这些边界时，这表明存在重复或缺失（假设探针靶向的序列的正常拷贝数为2）。然而，跨越任意边界并不一定意味着探针的目标序列确实被删除或重复！例如，同一探针在参考样本上的95%置信区间也可能跨越任意边界。在这种情况下，样本中的探针结果可能与参考样本没有不同。
显示结果
提供了在网格、比率图和PDF报告中显示探针结果的可能性。图3概述了可能的探针结果以及它们在Coffalyser的不同区域中如何显示。
情况1： 探针结果不表明拷贝数变化：在PDF报告中，比率为黑色字体，[REF]列中显示等号（=），网格中显示灰色或绿色单元格（目标探针）和黄色单元格（参考探针）。在比率图中，探针的95%置信区间估计与同一探针在参考样本上的95%置信区间重叠（蓝色框）。
情况2： 探针结果表明与参考样本相比信号显著降低，因为计算出的降低超过两个标准差。在PDF报告中，比率为斜体，黑色字体。在[REF]列中，这由两个小于括号（<<）表示。在网格中，单元格为紫色，表示未跨越下任意边界。在比率图中，误差条与同一探针在参考样本上的95%置信区间不重叠（蓝色框）。
情况3： 探针结果表明与参考样本相比信号显著增加，因为计算出的增加超过两个标准差。在PDF报告中，比率为斜体，黑色字体。在[REF]列中，这由两个大于括号（>>）表示。在网格中，单元格为紫色，表示未跨越上任意边界。在比率图中，误差条与同一探针在参考样本上的95%置信区间不重叠（蓝色框）。
情况4： 探针结果表明杂合缺失（假设探针通常靶向两个拷贝）。计算出的降低超过两个标准差，并且跨越了下任意边界。在PDF报告中，比率为粗体和斜体，红色字体。在[REF]列中，这由两个带星号的小于括号（<<*）表示。在网格中，单元格为亮红色。在比率图中，误差条与同一探针在参考样本上的95%置信区间不重叠（蓝色框），并且探针比率跨越下任意边界（红线）。
情况5： 探针结果表明杂合重复（假设探针通常靶向两个拷贝）。计算出的增加超过两个标准差，并且跨越了上任意边界。在PDF报告中，比率为粗体和斜体，蓝色字体。在[REF]列中，这由两个带星号的大于括号（>>*）表示。在网格中，单元格为深蓝色。在比率图中，误差条与同一探针在参考样本上的95%置信区间不重叠（蓝色框），并且探针比率跨越上任意边界（蓝线）。
情况6： 探针结果表明与参考样本相比信号非显著降低，因为仅计算出一个标准差的降低。然而，跨越了下任意边界。在PDF报告中，比率为粗体和斜体，红色字体。在[REF]列中，这由一个带星号的小于括号（<*）表示。在网格中，单元格为浅红色。在比率图中，误差条与同一探针在参考样本上的95%置信区间重叠（蓝色框），并且探针比率跨越下任意边界（红线）。
情况7： 探针结果表明与参考样本相比信号非显著增加，因为仅计算出一个标准差的增加。然而，跨越了上任意边界。在PDF报告中，比率为粗体和斜体，蓝色字体。在[REF]列中，这由一个带星号的大于括号（>*）表示。在网格中，单元格为浅蓝色。在比率图中，误差条与同一探针在参考样本上的95%置信区间重叠（蓝色框），并且探针比率跨越上任意边界（蓝线）。
情况8： 探针结果不确定，尽管（在这种情况下）跨越了下任意边界。在PDF报告中，比率为斜体，棕色字体。在[REF]列中，这由问号（?）表示。在网格中，单元格为白色。在比率图中，探针比率点为黄色。
情况9： 探针结果表明一种奇怪的、不常见的情况，其中大多数参考样本对该探针没有信号。比率是基于有信号的参考样本计算的，这是危险的。这种情况最常出现在特殊探针混合物中，当不使用专用参考样本时，和/或当选择了不正确的参考样本时。在PDF报告中，比率为斜体，棕色字体。在[REF]列中，这由术语INF表示。在网格中，单元格为橙色。在比率图中，探针比率点为橙色。
情况10： 探针结果表明未找到信号。在PDF报告中，比率为粗体和斜体，红色字体。在[REF]列中，这由两个带两个星号的小于括号（<<）表示。在网格中，单元格为黄色。在比率图中，探针比率点为红色。
注意： 在上述情况中，假设参考样本上探针的平均值为1.0。
分析
尽管在MS-MLPA分析中为每个探针计算了甲基化比率，但只有甲基化特异性探针（包含HhaI位点）的比率指示样本的甲基化状态。在Coffalyser中，这些探针在其名称中标记有[HhaI]。
计算的甲基化特异性探针的甲基化比率指示样本中甲基化的拷贝数。因此，要了解样本中探针的甲基化状态，了解其拷贝数很重要。表1列出了一些示例。
拷贝数分析 甲基化状态分析
最终比率拷贝数甲基化结果甲基化拷贝数
为了确定获得的结果是否表明异常，应将其与参考样本的结果进行比较，预计参考样本在感兴趣区域具有正常的拷贝数和甲基化状态。
Coffalyser为每个探针的甲基化状态计算参考样本的95%置信区间（图5中下部比率图中的蓝色框）。这表示在100个参考样本中，预计有95个样本的探针甲基化值落在该范围内。还为样本中的每个探针计算95%置信区间估计，这表示在100次对该样本的实验中，预计有95次实验的探针甲基化状态落在该范围内（图5中下部比率图中与探针结果相关的误差条）。
任意边界
Coffalyser还在拷贝数和甲基化比率图中显示任意边界，为红色（下任意边界）和蓝色（上任意边界）线。默认情况下，边界设置为参考样本上探针平均值的±0.3。例如，当参考样本上探针的平均值为0.95时，下任意边界设置为0.65（0.95-0.3），上任意边界设置为1.25（0.95+0.3）。在甲基化图中，参考样本上探针的平均值对于每个探针都是不同的（例如，由于HhaI限制位点的存在、实验变异），因此任意边界不是直线。
当探针的甲基化状态跨越这些边界时，这表明与参考样本相比甲基化状态存在差异。然而，跨越任意边界并不一定意味着探针的目标序列的甲基化状态确实异常！例如，同一探针在参考样本上的95%置信区间也可能跨越任意边界。在这种情况下，样本中的探针结果可能与参考样本没有不同。
在Coffalyser中显示结果
在比较分析实验资源管理器中，Coffalyser默认将样本的未消化和消化对应物的结果直接相邻显示（见图4）。
在比较分析样本结果资源管理器的比率图选项卡中，Coffalyser通常显示两个比率图。对于所选样本，上部图表显示未消化对应物的结果，即拷贝数分析，下部图表显示MLPA反应的消化对应物的结果，即甲基化状态分析（见图5）。
也可以比较分析实验资源管理器的比率概述选项卡和比较分析样本结果资源管理器的比率图选项卡中分别查看未消化或消化样本的结果。
程序：更改比较分析实验资源管理器的比率概述选项卡中的结果显示
1. 在比较分析实验资源管理器的RATIO OVERVIEW选项卡中，右键单击并选择Show Data Type。
2. 从出现的列表中选择DNA或MS，分别仅显示未消化样本或消化样本的结果。
3. 要再次查看组合结果，请按照步骤1和2并选择DNA/MS。
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