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Proimmune全国代理
产品时间:2020-05-16
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掌握免疫

我们可以帮助您了解和管理免疫反应。无论您的目标是基础研究,临床前还是临床开发,我们为免疫学研究提供的独特解决方案都可以为您节省时间,金钱和风险。

 

嵌合A2KbPro5®MHC I类五聚体

 

转基因小鼠模型已成为评估假定的人类抗原疫苗接种的重要工具。HLA-A2转基因小鼠表达结合了HLA-A * 02:01的alpha-1和alpha-2结构域与H-2Kb的alpha-3结构域的修饰的I类MHC分子。

 

为了研究在这种小鼠中的细胞毒性T细胞免疫应答,已经提出可以使用嵌合的A2Kb多聚体以便准确地检测相关的免疫应答。

 

生物素标记的Pro5®Pentamers和Pro5®Biotag

 

 

生物素标记的五聚体的多种应用

生物素标记的Pro5®MHC I类五聚体允许枚举和分离抗原特异性CD8 + T淋巴细胞。多聚体MHC-肽复合物结合特定特异性的T细胞受体(TCR),如MHC等位基因和肽组合所确定的。可以通过流式细胞术分析用生物素标记的Pro5®Pentamers染色的CD8 + T细胞,然后用荧光链霉亲和素偶联物染色,以确定抗原特异性T细胞的频率。

 

通过使用链霉亲和素包被的磁性微珠,生物素标记的五聚体也可以用于分离或消除抗原特异性CD8 + T细胞。如果需要获得活细胞用于进一步分析,例如T细胞培养或基因表达谱分析,则以这种方式分离抗原特异性T细胞非常有用。生物素标记的五聚体也可用于基于板的测定(如ELISA)中,可将其固定在链霉亲和素包被的表面上。

 

Pro5®Biotag是一种生物素标签蛋白,可与未标记的Pro5®Pentamers特异性结合,可作为辅助试剂用于流式细胞仪分析。可以通过流式细胞术分析用五聚体加Pro5 Biotag结合选择的荧光标记的链霉亲和素缀合物染色的CD8 + T细胞,并确定抗原特异性T细胞的频率。因此,将Biotag与未标记的五聚体一起使用可提高实验灵活性,并增强Pentamer染色的应用能力。

 

 

 

应用:流式细胞术

可以通过流式细胞术分析用生物素标记的五聚体与选择的荧光标记的链霉亲和素结合物染色的CD8 + T细胞,以确定抗原特异性T细胞的频率。多种与链霉亲和素结合的荧光染料可与生物素标记的五聚体一起使用,从而在多通道流式细胞仪染色实验中增加了灵活性。

 

下图显示了示例性染色,其中使用B * 08:01 / RAKFKQLL(EBV BZLF-1)特异性生物素标记的Pentamer,然后用SA-PE,SA-PerCP或SA染色1 x 106个外周血细胞-PE Cy5。即使每个荧光标记的荧光强度都不相同,也可以实现相似程度的抗原特异性染色。

 

 

 

应用:分离T细胞

使用生物素标记的五聚体与链霉亲和素包被的顺磁珠结合,可以轻松分离或清除抗原特异性CD8 + T细胞。ProImmune的生物素标记五聚体适用于任何微珠系统和微珠供应商,这意味着它们可与现有试剂和设备一起使用。如果需要获得活细胞用于进一步培养或分析(例如表达谱分析),则以这种方式分离抗原特异性T细胞很有用。

 

下图显示了使用B * 08:01 / RAKFKQLL(EBV BZLF-1)特异性生物素标记的Pentamer从外周血悬浮液中清除抗原特异性细胞的过程。将原始细胞群(耗尽前)和分离后(耗尽后)上清液的样品与抗CD8-FITC抗体和SA-PE孵育,以观察抗原特异性细胞。抗原特异性种群从1.53%减少到0.04%,证实了EBV BZLF-1细胞的珠分离成功。

 

 

 

应用:培养细胞的扩增

人工抗原呈递已经成为刺激和扩增培养细胞的重要工具。生物素标记的五聚体可与>2μm链霉亲和素标记的顺磁珠偶联,并与共刺激抗体(如生物素化的抗CD28和抗CD40抗体)结合使用,以在体外刺激单个抗原特异性T细胞。

 

 

 

应用:免疫分析

可以将生物素标记的五聚体固定在任何抗生蛋白链菌素包被的表面上,以用于体外测定,例如基于板的ELISA。五聚体特别适用于该实验平台,因为分子的扩展方向结构意味着提供/提供了高拷贝数的MHC分子。

 

在下图中,用A * 02:01特异性生物素标记的Pentamer的系列稀释液包被了96孔ELISA板。通过加入抗A * 02:01构象抗体,然后加入抗小鼠Ig-HRP和TMB(3,3',5,5'–四甲基联苯胺),可以观察结合的五聚体。在450nm处读取板,并且该图显示了五聚体浓度相对于吸光度。

 

ELISA固定化生物素化的Pro5®MHC I类五聚体

 

 

通讯协定

生物素标记的Pro5®MHC Pentamer的细胞染色方案(2层染色)

所需材料

洗涤缓冲液(0.1%叠氮化NA,0.1%BSA的PBS溶液),固定液(1%胎牛血清,2.5%的甲醛的PBS溶液),对所选抗原具有特异性的生物素标记的Pro5®Pentamer,荧光标记的链霉亲和素缀合物,抗CD8抗体(与链霉亲和素偶联物的荧光不同)。

 

 每个染色条件分配1-2 x 10 6个淋巴样细胞(PBMC或脾细胞)。( 由于抗原特异性T细胞的频率高,使用T细胞克隆或品系时,每个染色条件只能分配2-5 x 10 5个细胞)。

用洗涤缓冲液洗涤细胞,并将其重悬于剩余体积(50μl)中。

每个染色条件添加一个测试(10μl)生物素标记的五聚体。

在室温下孵育10 – 15分钟。

用10倍体积的洗涤缓冲液洗涤细胞。

每个染色条件添加最jia滴定量的荧光标记的链霉亲和素和抗CD8抗体。

在黑暗中于冰上孵育20至30分钟。

将细胞在洗涤缓冲液中洗涤两次,并在黑暗中保存在固定溶液中。

现在,细胞已准备好进行流式细胞仪分析。通过首先在活淋巴样细胞上进行门控,然后在双色图上进行分析,在X轴上显示CD8,在y轴上显示Pentamer,可以方便地查看Pentamer阳性细胞。

 

未标记的Pro5®MHC Pentamer plus Biotag的细胞染色方案(三层染色)

所需材料

洗涤缓冲液(0.1%叠氮化na,0.1%BSA的PBS溶液),固定液(1%胎牛血清,2.5%的甲醛的PBS溶液),针对所选抗原的未标记Pro5®Pentamer,Pro5®Biotag,荧光标记的链霉亲和素偶联物,抗CD8抗体(与链霉亲和素偶联物的荧光不同)。

 

 每个染色条件分配1-2 x 10 6个淋巴样细胞(PBMC或脾细胞)。( 由于抗原特异性T细胞的频率高,使用T细胞克隆或品系时,每个染色条件只能分配2-5 x 10 5个细胞)。

用洗涤缓冲液洗涤细胞,并将其重悬于剩余体积(50μl)中。

每个染色条件添加一个测试(2μl)未标记的五聚体。

在室温下孵育10 – 15分钟。

用10倍体积的洗涤缓冲液洗涤细胞。

添加一个测试(8μl)Pro5®Biotag。

在冰上孵育20至30分钟。

每个染色条件添加最jia滴定量的荧光标记的链霉亲和素和抗CD8抗体。

在黑暗中于冰上孵育20至30分钟。

将细胞在洗涤缓冲液中洗涤两次,并在黑暗中保存在固定溶液中。

现在,细胞已准备好进行流式细胞仪分析。通过首先在活淋巴样细胞上进行门控,然后在双色图上进行分析,在X轴上显示CD8,在y轴上显示Pentamer,可以方便地查看Pentamer阳性细胞。

 

磁珠隔离协议

所需材料

洗涤缓冲液(0.1%叠氮化na,0.1%BSA的PBS溶液),抗生蛋白链菌素珠(例如,来自Polymer Labs的Lodestars 2.7抗生蛋白链菌素;来自Dynal Biotech的Dynabeads M-280抗生蛋白链菌素)。为了获得最jia结果,至少应使用1 x 10 7个  淋巴样细胞(PBMC或脾细胞)。

 

用洗涤缓冲液洗涤细胞,并重悬于200ml洗涤缓冲液中。

每2 x 10 6个  细胞添加1个测试(10μl)生物素标记的Pentamer 。

在室温下孵育10分钟。

用洗涤缓冲液洗涤细胞,然后重悬于500μl洗涤缓冲液中。

加入最适量的链霉亲和素珠子(建议每细胞至少5个珠子)。

在冰上混合孵育30分钟。

用洗涤缓冲液将试管中的体积增加至2 ml,然后放入磁性颗粒分离器中。

静置3-5分钟。如果需要,可以保留上清液用于流式细胞仪分析,以确认已去除抗原特异性细胞。

用洗涤缓冲液洗涤含珠细胞复合物的部分3次,弃去上清液。

分离的珠细胞复合物可置于细胞培养物中,珠子应在几天后解离。

 

固体表面固定方案

所需材料

磷酸盐缓冲盐水(PBS),链霉亲和素,0.1M碳酸氢钠(NaHCO3),Tween-20,牛血清白蛋白(BSA)。

 

通过在0.1 M NaHCO3(pH 8.2)中于4ºC孵育过夜,以100 ng /孔的抗生蛋白链菌素(100μl/孔的96孔ELISA板)覆盖固体表面(例如ELISA板)。

用PBS / 0.05%Tween-20清洗表面3次。

用5%BSA / PBS(200μl/孔的96孔ELISA板)封闭,并在室温下孵育1小时。

用PBS / 0.05%Tween-20清洗表面3次。

加入50ng /孔生物素标记的Pentamer(或根据需要滴定),并在室温下孵育1小时。

用PBS / 0.05%Tween-20清洗表面3次,然后进行所需的测定。

 

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