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epicypher
产品时间：2020-04-11
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EpiDyne®染色质重塑酶
ATP依赖的染色质重塑酶是癌症中常见的突变蛋白之一，使其成为开发新型治疗策略的要目标。EpiDyne®平台利用EpiCypher dNucs作为底物来研究核小体重塑。为了补充这些测定，EpiCypher提供了一系列重塑酶，包括SMARCA2和SMARCA4（SWI / SNF复合体的ATPase）和ACF ISWI型复合体。epicypher一级代理
EpiDyne：下一代表观遗传学测定的工具
EpiDyne染色质重塑酶可用于多种测定读数，包括：
FRET （在此处阅读技术说明） –兼容HTS
辐射DAM甲基转移酶测定–与HTS兼容
限制酶的可及性（在此处阅读技术说明）
可及性*定义的核小体底层工程，用于染色质重塑研究
概述核小体重构(或重定位)调节染色质上的 dna 通路，从而影响基因表达和基因组修复。 许多 atp 依赖的重塑酶(及其多亚基复合物)与人类疾病相关，但由于对核小体基底物的需求，它们是*的具有挑战性的生物化学研究目标。 上胚层通过开发 epidyne 解决了这个问题，epidyne 是一系列重组核小体底物，可以在体外监测核小体重构活性。 在这里，我们描述了硬膜外核小体重构底物在限制酶可及性(rea)测定中的应用
染色质重塑作为治疗目标核小体组织，可以严重扰乱基因表达、 dna 修复和细胞分化，在许多人类疾病(如癌症、炎症、自身免疫、精神分裂症、心血管疾病和智能障碍)中发挥重要作用。 值得注意的是，近20% 的癌症含有来自依赖 atp 的 swi / snf 家族染色质重塑复合体亚基的突变。 这些酶复合体通过将 dna“泵”到组织八聚体周围来调节局部基因组访问，从而沿着 dna 重新定位核小体[1]。 在多种癌症中观察到 swi / snf 亚基的反复突变，这支持了肿瘤发生中的驱动因子作用[2]。 突变复合物是理想的治疗目标，因为进一步损害它们的 atp 酶活性会促进癌细胞死亡，但不会损害正常细胞[2,3]。 这种现象被称为人工合成杀伤性，利用它来识别抑制剂可能导致具有癌症特异性的药物[4,5]。 核小体重构实验利用重组单核小体亚层发展了 epidyne 家族的核小体重构底物来研究染色质再模拟酶的活性。核小体，147个碱基对的 dna 缠绕在核心组蛋白质周围，代表了染色质的基本重复单位。 硬膜外核糖核酸体是由一个重组的人组蛋白八聚体包裹在一个含有末端核小体定位序列(147个碱基对)的 dna 中，与一个70个碱基对的下游受体区相邻。这个位置的组蛋白八聚体保护了一个限制酶识别位点(例如 dpnii [ gatc ]或 mfe1[ caattg ]) ，这个位点是通过一个相关的核小体重塑以允许 dna 切割而暴露出来的(图1)。
这种第yi代 epidyne 底物还兼容高通量读数，例如与 gatc 特异性的 dammethyltransferase [6,7]进行放射标记。 我们目前正在开发与其他高温超导平台兼容的下一代重塑基板，包括荧光偏振和荧光分析。
图1: epidyne 核小体重塑亚层 epidesyne 核小体重塑底物包裹着一个强大的核小体定位序列(widom601) ，以屏蔽一个目标基序(绿盒子)。 目标基序要么是限制酶识别位点，要么是该死的甲基化序列。 橙色 dnasequence 代表基于70对的受体区域。 在依赖 atp 的重塑器(例如酵母菌 rsc，或人类 swi / snf atpase，例如 smarca2 / 4)作用后，目标部位暴露出来，然后可以用限制酶切割或用水坝甲基化。 后者可以立即兼容 hts 应用程序。
实验所需的试剂和材料: 贮存蛋白质 aliquots@- 80 c，避免冻结 / 解冻酵母 rsc 重构复合物[9](底物也与人类 smarca2 / 4 / brm / brg1复合物相容; 未显示)•硬膜内重构底物(epicypher catalog catalog no。16-4101)•阳性对照裸 dna 模板 gatc1(epicypher catalogno。 18-4101)•负面控制裸 dna 模板 gatc0(epicypher catalogno。 18-4100)•限制酶(对于 gatc 的乳沟，使用 dpnii (neb 目录编号 r0543t) ; 对于 cag 的乳沟，使用 mfei (neb 目录编号:。 分析缓冲液(20mm tris ph7.5,50mm kcl，3mm mgcl2和0.1 mg / mlbsa (sigma catalog no。 A3059)分析淬火缓冲液(新鲜: 10mm tris ph7.5,40mm edta，0.6% sds 和50g / ml 蛋白酶 k (worthington bio-chem。 公司，目录号码。 Proks). •8% 天然聚丙烯酰胺凝胶(37.5:1)在1xtbe-溴化乙锭(etbr，10mg / ml)中组装 / 分解• etbr 染色 dna 标准曲线成像装置1。 添加硬膜外基质，或者控制 dna (阳性或阴性)到0.5 ml 埃本多夫试管(建议三个试管并行运行)。 无痛分泌物的浓度会随你特定的 atp 酶而变化。 对于 rsc，使用20nm 核小体. 2。 在预定体积中加入测定缓冲液(典型反应为20l，相当于 ~ 100ng dna)3。 加入染色质重塑(例如 rsc，10nm)4。 加入50个所需限制酶(例如 dpnii)5。 通过加入2毫米 atp6引发反应。 在23-37摄氏度(rsc 为30摄氏度)孵化反应，以获得所需的时间点7。 通过添加等量的分析淬火缓冲剂来淬火反应，然后在50 °c 下培养20分钟。 非变性丙烯酰胺凝胶样品。 用 etbr (0.2 g / ml)在1xtbe 中染色10分钟。 在1xtbe 中注入凝胶，在合适的成像设备上进行可视化
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